小麦穗部病毒诱导基因沉默体系的建立及籽粒大小相关基因TaCYP78A3和TaCYP78A5的功能研究

发布时间：2020-07-16 08:02

【摘要】：小麦是世界上最重要的粮食作物之一;但随着全球人口数量激增,食物短缺问题已越发严重。因此,小麦产量性状相关基因的分离和功能研究对未来小麦分子育种至关重要。但由于小麦遗传转化瓶颈尚未突破,传统功能基因研究方法在小麦中难以广泛应用。近年来,大麦条斑花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技术已被广泛应用于小麦苗期抗病、抗虫相关基因的功能研究。小麦籽粒大小和粒重是影响小麦产量的重要因素之一;增加粒重是提高产量的有效途径。虽然,大量与种子大小相关基因(粒重基因)在模式植物拟南芥和水稻中被研究鉴定;但在重要粮食作物小麦中,种子大小相关基因的分离和鉴定鲜有报道;而且影响小麦籽粒大小的分子机制尚不清楚。因此,本研究首先建立了在小麦穗部有效实施BSMV-VIGS的方法体系;并探索应用该方法研究小麦穗部基因功能的可能性。其次,通过同源克隆的策略,分离小麦中两个潜在与籽粒大小相关的基因Ta CYP78A3和Ta CYP78A5。利用本研究建立的BSMV-VIGS方法沉默Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因在小麦籽粒中的表达,以及通过转基因拟南芥过表达靶基因,验证其是否具有控制籽粒大小的生物学功能。此外,通过细胞学观察和分子水平检测,初步探索了Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因控制籽粒大小的细胞学基础和分子机制。主要研究结果如下:1.以冬小麦品种小偃6号、陕优225和春小麦品种宁春16为试料,以PDS为靶基因,分别利用空病毒载体BSMV:00和携带185bp大麦PDS基因片段的重组病毒BSMV:PDS在不同时期(包括孕穗期、抽穗期和开花期)、不同部位(旗叶或穗部)摩擦接种小麦,研究建立了在小麦穗部BSMV病毒诱导内源基因沉默的方法体系,即从小麦抽穗期至扬花期,通过摩擦穗部的方式接种能得到最好的沉默效果。接种后22天导致内源PDSm RNA积累量显著降低92%及穗部和籽粒出现均匀光漂白现象。2.以功能已知的高分子量麦谷蛋白(HMW-Gs)1Bx14基因为靶标,用携带有1Bx14基因176bp特异片段的重组病毒BSMV:1Bx14,通过上述建立的BSMV-VIGS方法在小麦扬花期接种穗部,沉默靶标基因1Bx14的表达;并分析验证其生物学功能。结果表明用BSMV:1Bx14接种小偃6号和陕优225穗部,导致种子中HMW-Gs-1Bx14基因在m RNA水平和蛋白水平上分别显著降低了85%-97%和64%-67%;进一步分析表明1Bx14基因的沉默导致籽粒面筋强度降低。这与前人研究显示的HMW-1Bx14蛋白是对小麦面筋强度及烘烤品质有贡献的研究结果相一致。该实验表明小麦穗部BSMV-VIGS体系可有效应用于小麦籽粒表达基因功能。3.利用同源克隆策略,首次在大粒小麦品种陕512中分离得到了CYP78A家族的两个籽粒大小相关基因Ta CYP78A3和Ta CYP78A5,它们分别为功能未知的大豆Gm CYP78A3和功能已知的拟南芥CYP78A5直系同源基因。Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因均包含一个内含子、两个外显子;它们分别编码小麦细胞色素P450 CYP78A3和CYP78A5蛋白。与其它CYP78A家族成员一样,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5蛋白均包含三个功能结构域,即N端疏水区、氧结合位点和亚铁血红素结合位点。4.实时定量RT-PCR分析时空表达模式显示,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因均在小麦种子发育初期高表达。利用上述BSMV-VIGS技术在小麦种子发育阶段分别抑制Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因的表达,结果导致小麦种子大小分别显著降低11%和9%(P0.01)。细胞学观察发现,种子大小降低的主要原因是由于Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因表达被抑制导致了小麦胚珠和种子发育阶段表皮细胞增殖速度降低,最终导致种子外表皮细胞数目分别降低了11%和10%。5.在拟南芥中过表达Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因导致了拟南芥种子分别显著增大11%-47%和11%-35%(P0.01)。细胞学观察进一步证实,种子增大的主要原因是由于Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因过表达促进了拟南芥胚珠和种子发育阶段表皮细胞增殖,最终导致种皮增大。同样,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因也能在种子发育阶段通过促进胚表皮细胞增殖来影响胚的发育,这最终也影响种子的大小。但不幸的是,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因过表达会导致胚珠表皮细胞过度增殖,引起胚珠发育缺陷,进而导致转基因拟南芥结实降低。6.转基因恢复实验进一步证明小麦Ta CYP78A5基因与拟南芥CYP78A5的直系同源基因。Ta CYP78A3基因与拟南芥CYP78A5和CYP78A9基因在控制种子和生殖器官发育方面功能不冗余,且可能独立于Da1、TTG2、ARF2和AP2这些已知母性因素之外影响表皮细胞增殖。此外,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因在拟南芥中的过表达导致了拟南芥生育期延长了大约2周;但生育期的延长并未带来产量的提高。这是由于Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因表达量的降低会导致种子大小的降低;而过表达会导致结实率降低。总之,本研究首次在小麦穗部中建立了基于BSMV的VIGS体系,验证了其可行性;并应用该技术研究了小麦籽粒大小相关基因Ta CYP78A3和Ta CYP78A5的生物学功能。本研究建立的小麦穗部BSMV-VIGS的方法可为小麦籽粒品质、产量、发育和穗部抗病相关基因功能的研究提供一种有效的技术途径;同时也为其他单子叶植物穗部表达基因的功能研究提供了一个重要的参考。此外,小麦Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因功能的研究,初步揭示了小麦Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因通过促进胚珠和种子表皮细胞增殖来影响种子大小的分子机制。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.12;Q943.2

【参考文献】