中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析

发布时间：2020-08-12 16:30

【摘要】：近年来,自然环境破坏严重,蜜蜂的饲养环境持续恶化,蜂群崩溃失调现象(Colony collapse disorder,CCD)频发。美国、欧洲部分地区的西方蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)损失量超过30%,因此造成的直接蜂群损失和继发的作物损失不可估量。CCD的原因尚未明确,各种疾病的肆虐和农药的大量使用均成为了学者们的猜测对象。西方蜜蜂和东方蜜蜂(Apis cerana Fabricius)均属于蜜蜂属,亲缘关系较近,意大利蜜蜂(A.m.ligustica,简称意蜂)和中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)分别是其中的代表。意蜂在我国的饲养量远超中蜂,在部分地区甚至出现混养现象,可是意蜂出现的CCD现象并未在中蜂群中出现,其中缘由尚未可知,因此探究中蜂自身的免疫机理势在必行。蛋氨酸甲基亚砜还原酶B具有清除机体自由基、保护机体免受氧化损伤、抵御外源毒物的作用;铁代谢相关蛋白则通过调节体内游离铁水平避免产生自由基,清除体内已有活性氧、防止病原微生物侵染作用。本研究以中华蜜蜂(A.c.cerana)为实验材料,开展了蛋氨酸甲基亚砜还原酶B(methionine sulfoxide reductase B,MsrB)和铁代谢相关蛋白(转铁蛋白(Transferrin)、铁蛋白(Ferritin))基因的功能研究,从分子水平上探讨中蜂自身免疫力与中华蜜蜂蛋氨酸甲基亚砜还原酶B及铁代谢相关蛋白基因的联系。具体研究结果与主要结论如下:(1)中蜂Acc MsrB基因的分子特性和功能分析根据意蜂(A.melliferaligustica)的同源序列,利用RT-PCR和RACE-PCR的方法,首次克隆了中蜂MsrB基因,命名为AccMsrB(GenBank注册号:KP317814)。序列分析表明,其cDNA全长为757 bp,包括138 bp的5′非翻译区(UTR)、205 bp的3′非翻译区(UTR)和414 bp的开放阅读框(ORF),编码一段137个氨基酸的多肽,分子量和等电点分别为15.5 kDa和7.77。氨基酸序列比对分析发现AccMsrB的氨基酸序列与其他昆虫,特别是蜜蜂科昆虫MsrBs有较高的同源性,并具有MsrBs中保守的功能区域。用TFSEARCH软件分析AccMsrB启动子,预测到两个与调节环境应激有关的转录因子(HSF和Dfd)。表明,AccMsrB基因可能参与发育和环境应激响应。采用qRT-PCR和免疫组织化学的方法研究了Acc MsrB在不同发育时期和组织中的时空表达特性,结果表明,AccMsrB在整个变态发育过程中均表达,其中在变态发育节点:1龄幼虫(L1)、预蛹期(prepupa,PP)及15日龄成蜂(A15)时期表达量最高;在各组织中表达量呈现差异,其中表皮中表达量最高,肌肉中次之;免疫组织化学结果也显示accmsrb在体壁和眼部组织存在。表明accmsrb可能与幼虫发育阶段转换、抵御外界氧化损伤及清除体内自由基等功能相关。应用qrt-pcr方法探究了accmsrb在成蜂中不同应激处理下的表达特性。结果表明,accmsrb基因受非适宜温度、uv、h2o2、农药、重金属等因素应激的诱导表达。各因素处理后蜜蜂体内h2o2浓度保持在高浓度,验证了这种诱导是氧化应激的结果,表明accmsrb可能在氧化应激中发挥重要作用。(2)中华蜜蜂铁代谢相关蛋白基因的分子特性和功能分析利用上述方法,首次克隆了中华蜜蜂铁代谢相关基因,分别命名为:acctf(genbank注册号:jf330111.1)、accfth及accftl(genbank注册号:jf330112.1和jf340051.1)。该组基因cdna全长分别2346、1028及1018bp,其中5′非翻译区分别为74bp、219bp和274bp,3′utr分别为133bp、134bp和90bp,orf分别为:2139bp、675bp和654bp,分别编码包含712、219和218个氨基酸残基的多肽,分子量分别为78.6、25.5及25.2kda,等电点分别为7.07、6.25及6.52。氨基酸序列比对分析发现acctf、accfth及accftl的氨基酸序列与其他昆虫相关序列同源性较高。对铁代谢相关基因进行基因序列分析,发现在accfth的5′utr存在该基因家族的保守序列——铁反应元件(ire),该元件可以形成茎环结构,是铁调节蛋白的结合位点,在调控铁吸收与释放代谢过程起重要作用;通过分析启动子区域发现,该区域含有部分与免疫相关的转录因子(hsf、ap-1、nrf2、nfκb等);分析氨基酸序列发现,在转铁蛋白n-端含有该基因家族的保守氨基酸构成的铁结合位点;铁蛋白重链中含有构成铁氧化中心的保守氨基酸及保守的半胱氨酸;轻链序列中存在保守的糖基化位点(n-e-f)及保守的半胱氨酸。表明acctf、accfth及accftl是典型的转铁蛋白及铁蛋白,可能参与蜜蜂的铁代谢和应激保护机制。利用qrt-pcr方法研究了acctf、accfth基因在不同发育时期和组织中的时空表达特性。结果表明,该基因分别在l4及pp高水平表达,表明转铁蛋白及铁蛋白可能参与蜜蜂发育时期的转换。在不同组织间,acctf主要在蜜蜂脂肪体内生成,铁蛋白则在各个组织中均有表达,其中中肠组织为主,均与其他物种中该组基因的表达模式相近。应用qrt-pcr的方法研究了acctf和accfth基因在不同条件下的表达特性。表明,acctf在受到非适宜温度、各种氧化应激和农药处理后均出现诱导上调,accfth基因则只是在部分条件下出现表达上调,在4℃、42℃及农药处理时出现了抑制现象。表明,中华蜜蜂转铁蛋白和铁蛋白可能在中华蜜蜂应对大多数不利因素的应激保护中发挥重要作用。用FeCl3处理后,随着蜜蜂体内铁离子浓度上升,转铁蛋白AccTf和AccFTH基因都出现了表达上调,说明它们受到体内游离铁的诱导,能够起到储存和转运铁离子的作用,以此抑制体内氧自由基的形成,起到保护机体免受氧化损伤的作用。以上结果说明,Acc MsrB、AccTf、AccFTH及AccFTL基因分别具备各自基因家族的典型特征,均具有清除体内活性氧、抵御外源性氧化应激的作用,转铁蛋白和铁蛋白共同完成蜜蜂体内铁转运和储存,调节体内铁离子浓度,进而提高蜜蜂抗氧化能力。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S891

【共引文献】