枳（Poncirus trifoliata）低温相关microRNAs鉴定及ptf-miR396b抗寒功能研究

发布时间：2020-08-21 03:42

【摘要】：mi RNAs(micro RNAs)是普遍存在于动植物体内的一类内源保守非编码小分子RNA,mi RNA和AGO蛋白结合形成RISC复合物,在转录后水平对其靶基因m RNA进行剪切或翻译抑制,从而调控靶基因的表达水平。mi RNA参与调控植物的生长、发育、开花结果、衰老、死亡及对非生物、生物逆境胁迫响应等。枳(Poncirus trifoliata)是柑橘近缘属,抗寒性强,但枳中响应低温的mi RNAs却很少有研究。本研究采用高通量测序、生物信息学分析等技术挖掘枳低温相关mi RNAs,研究这些mi RNAs与其靶基因在枳应答低温胁迫中的功能。主要实验结果如下:1.以低温4℃驯化3d(CA)和未驯化(Control)的枳叶片进行高通量小分子RNA测序。对高通量测序结果进行生物信息学分析,共鉴定出107个保守mi RNAs,分别属于44个mi RNA家族,有36个mi RNAs响应低温胁迫,其中14个mi RNAs在其它物种中未见有参与低温胁迫的报道。此外,预测了5个新mi RNAs。靶基因多数是转录因子,实时定量验证了mi RNAs表达与测序结果一致。2.在柑橘不抗寒类型柠檬中超表达ptf-mi R396b前体基因MIR396b,成熟ptf-mi R396b表达水平在转基因柠檬中大幅提高,且转基因柠檬相比野生型表现出更强的抗寒性,组织化学染色和生理指标测定也证实了转基因柠檬的抗寒性增强。5’-RACE和农杆菌介导的瞬时转化证实Ptr ACO是ptf-mi R396b的靶基因,两者在枳响应低温胁迫中具有相反的表达模式。实验证明ptf-mi R396b上调抑制Ptr ACO表达,进而抑制了乙烯合成,同时多胺合成相关基因被诱导上调,多胺含量积累量升高。转基因柠檬低温处理后,Ptr ACO表达水平比野生型更低,乙烯释放量低于野生型,乙烯和多胺合成的共同底物SAM更多地进入多胺合成途径,多胺合成相关基因表达水平及多胺积累量均高于野生型。ptf-mi R396b通过调节其靶基因Ptr ACO的表达水平维持乙烯和多胺合成平衡,从而调控枳对低温胁迫的响应。3.本实验中发现两个新的ptf-mi Rn02和ptf-mi Rn04产生于同一个茎环结构的两条臂上,且ptf-mi Rn04的测序丰度比ptf-mi Rn02高,ptf-mi Rn02可能是ptf-mi Rn04的mi RNA*,本章克隆鉴定了枳ptr-mi Rn04及ptr-mi Rn02的成熟序列和前体序列,预测ptf-mi Rn04的靶基因是Ptr FBA基因,该基因参与糖代谢且与ptr-mi Rn04的表达水平呈反向相关,在烟草中超表达ptf-mi Rn04前体基因降低了烟草的抗寒性,ptf-mi Rn04在低温胁迫响应中是一个负调控因子。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S666

【参考文献】

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本文编号：2798873