【摘要】：新疆红肉苹果是新疆野苹果的变型,是我国珍贵的野生果树资源,其枝、叶、花、果均为红色,美丽鲜艳,并且果实中富含花青苷和多酚等抗氧化物质,具有较高的观赏价值和丰富的医疗保健功能,但其肉质多松软,汁少,风味甜、淡甜或甜酸略有涩味,果实品质有待改良。为此,本课题组于2006年在国内率先构建了新疆红肉苹果和富士等栽培苹果杂交群体。本研究以新疆红肉苹果杂交群体为试材,针对杂交后代红色性状的遗传基础不明确、红绿性状分离规律不清楚、红肉苹果愈伤组织培养及体细胞无性系变异等问题展开了相关研究,旨在明确苹果红色性状遗传规律和发育机理,为新疆红肉苹果的育种和开发利用提供理论支持。主要研究结果如下:1.在杂交后代红色单株中克隆到MdMYB10基因,其cDNA编码序列(CDS)与MdMYB10_Maypole(AB744002)序列完全一致,与MdMYB1_Golden Delicious(DQ886415)和MdMYBA_Tsugaru(AB279598)同源性均为99%;其启动子序列,与MdMYB10_niedzwetzkyana(EU518250)同源性为99%,也含有R6重复序列,与MdMYB1_Golden Delicious(DQ886415)启动子序列同源性也高达98%。2.对F1分离群体中8个红色单株和8个绿色单株及‘紫红1号’和‘红富士’回交BC1群体中95个红色单株和5个绿色单株MdMYB10位点基因型进行了PCR鉴定,结果发现MdMYB10基因为红色单株特有。3.MdMYB10/MdMYB10×MdMYB1/MdMYB1杂交组合后代基本全为红色(95%),但有5%左右的绿色类型。MdMYB1/MdMYB10×MdMYB1/MdMYB1的12个杂交组合间红绿分离比存在差异,总体为0.6:1,其中2个杂交组合红绿分离比接近1:1,分别为0.89:1和0.83:1;但3个杂交组合红绿分离比仅约0.2:1。对MdMYB10/MdMYB10×MdMYB1/MdMYB1杂交组合后代中9个绿色单株进行了SSR鉴定,其中有6个绿色单株能够确认为杂种。证明红色性状是由MdMYB10基因控制的显性性状,但MdMYB10位点可能存在某种突变机制。4.用红色优株‘紫红3号’叶片诱导了红色愈伤组织,通过液相质谱联用鉴定出3种花青苷,分别是矢车菊-3-半乳糖苷、矢车菊-3-阿拉伯糖苷和矢车菊-3-木糖苷,其中矢车菊-3-半乳糖苷含量最多,占总峰面积的94%以上。NAA 0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L为花青苷诱导的最佳激素组合,3%蔗糖是最适合作为红肉苹果愈伤组织培养的糖源,低氮有利于红肉苹果愈伤组织花青苷的积累但抑制愈伤组织的生长,缺氮条件下花青苷含量最高可达2mg/g。生长素抑制花青苷的合成,低浓度下愈伤组织为红色,但在高浓度下变为黄色。细胞分裂素在一定浓度范围内促进愈伤组织花青苷合成,但超过最适浓度,产生抑制。细胞分裂素与生长素一起用对花青苷合成的促进作用大于单用细胞分裂素,说明生长素和细胞分裂素在调控花青苷合成上有互作。5.研究了红色愈伤组织和黄色愈伤组织中花青苷合成相关基因(MdCHS、MdCHI、MdF3H、MdDFR、MdLDOX、MdUFGT、MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1)的表达差异,结果表明除了MdTTG1,其它基因在红色愈伤组织中表达量均高于黄色愈伤组织。进一步研究表明,红肉苹果愈伤组织在0.25 mg/L 2,4-D处理后2h能快速响应生长素信号抑制花青苷合成基因的表达。6.研究了红色愈伤组织和黄色愈伤组织中生长素信号途径ARF和IAA基因家族成员的表达差异,筛选到12个差异表达的IAA基因和13个ARF基因,进一步通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验证明MdARF3和MdARF4蛋白可以与MdMYB10蛋白互作。7.以红色愈伤组织和黄色愈伤组织为试材,进行了转录组测序,分析了黄色愈伤组织相对于红色愈伤组织的转录组表达差异,结果发现NAA和2,4-D处理分别有2,515和3,052个差异表达基因(log2 ratio≥2且P≤0.0001),其中花青苷代谢途径及苯丙氨酸代谢其它支路上结构基因的表达均被抑制,花青苷和原花青素向液泡转运相关蛋白的基因表达也被抑制,参与花青苷合成调控的MYB和bHLH转录因子的表达量均被下调。生长素信号途径有9个AUX/IAA家族基因和7个ARF家族基因的表达被高浓度NAA和2,4-D共同上调。高浓度NAA和2,4-D共引起了42个MYBs、17个bHLHs、17个WRKYs、17个NACs、6个bZIPs、4个TCPs、16个Homeoboxs、9个HSFs、2个G2-likes和4个SBPs转录因子的差异表达,广泛参与了细胞的生理代谢,并且影响了细胞分裂素、乙烯及赤霉素等其它激素信号途径基因表达,说明生长素对花青苷代谢的调控是多途径共同参与的结果。8.在红肉苹果组织培养再生过程中发现一株绿色突变体,花青苷含量显著低于红色组培苗。SSR证明绿色突变体确实来源于红色组培苗。花青苷合成结构基因表达量在绿色突变体中均低于红色组培苗,调控基因MdMYB10表达量红色组培苗是绿色突变体的6倍。对MdMYB10位点基因型鉴定并结合测序结果表明,绿色突变体是由于MdMYB10基因的缺失突变造成的。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S661.1
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2796256
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