鸡传染性支气管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

发布时间：2020-09-28 12:50

　　 鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitism, IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)引起鸡的一种高度传染性呼吸道疾病,IB可以感染所有日龄的鸡,能在多种组织细胞中复制,引发呼吸道疾病、腹泻和产蛋量下降等,给造成养禽生产带来巨大的经济损失。在这项研究中,通过制备针对QX型IBV毒株-Sczy3S1蛋白的单克隆抗体,并用该单克隆抗体对Sczy3 S1蛋白的抗原表位进行定位研究,进一步认识S1蛋白的分子结构和抗原表位结构,为研究表位疫苗和基于表位的诊断试剂提供科学依据。本研究首先对Sczy3 S1蛋白进行生物信息学分析,结果表明S1蛋白结构的二级结构以p-折叠和转角为主,并有少量无规则区域；含有较多的两亲性α-螺旋和p-折叠区域,柔性区域和表面可及性区域,有较好的免疫原性。选择抗原性较强的区域81aa-422aa,建立了Sczy3 S1原核表达载体,进行原核表达。扩增其核苷酸序列并克隆至pET-32a(+)载体中,将阳性重组质粒pET-32-S1转化感受态细胞E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组表达蛋白His-S1,成功表达出了大小约为57.5kDa的重组蛋白。表达蛋白His-S1经IPTG诱导浓度优化和诱导时间优化后,大量表达,用HisTrap FF crude亲和层析纯化,纯化效果达到90%以上。用BAB L/c鼠抗Sczy3高免血清与重组蛋白His-S1做Western blot分析,结果表明重组蛋白与鼠抗Sczy3高免血清有较好的反应性,可用于针对S1蛋白单克隆抗体的筛选。利用差速离心法纯化IBV Sczy3全病毒作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,并用BALB/c鼠高免血清和BALB/c鼠阴性血清建立ELISA检测方法。Sczy3病毒免疫BALB/c鼠4次后,取脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,融合的诱导剂为PEG1500,共进行3次融合。融合细胞首先用Sczy3纯化病毒为包被抗原ELISA检测,筛选出Sczy3日性单克隆抗体；Sczy3阳性单克隆抗体用重组蛋白His-S1作为包被抗原第二轮His-S1-ELISA检测,筛选出针对Sczy3 S1蛋白的阳性单克隆抗体。阳性单抗用Sczy3和重组蛋白His-S1经过Western blot方法检测,最终获得了两株能够稳定分泌IBV SI蛋白单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株1D5和6A12。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒检测两株单克隆抗体均为IgM亚型。与AIV(H5、H9亚型)、NDV ELISA反应,mAbs1D5和6A12特异性良好。与其他10株IBV毒株ELISA反应,mAbs 1D5和6A12具有交叉反应性,mAb 1D5与CK/CH/SCYA/10I和CK/CH/SCMY/10I的反应性低,比6A12交叉反应性差。Sczy3的第8代尿囊液病毒接种CEK细胞,建立Sczy3 CEK细胞适应株Sczy3-C。 Sczy3-C第20代测定TCID50,结果为10-5.64/0.2 mL。终点法中和试验测定mAbs 1D5和6A12的中和性,mAbs 1D5和6A12都具有中和性,mAb 1D5的中和效价为1：40.6,mAb 6A12的中和效价为1：44.7。制备出的mAbs 1D5和6A12是针对Sczy3 S1蛋白的中和性单克隆抗体。为了鉴定制备的mAbs 1D5和6A12在IBV Sczy3 SI蛋白上所对应的表位,将mAb1D5和6A12作为靶分子包被ELISA板,用噬菌体展示随机12肽库进行生物淘选。经过3轮淘选,每轮增加Tween-20浓度和降低靶分子包被浓度来增加筛选强度。两株单抗均随机挑选10个噬菌体克隆进行扩增和ELISA鉴定,阳性噬菌体PCR扩增获得核心序列并测序。mAbs 1D5和6A12均获得3条序列,与Sczy3 S1蛋白比对序列发现mAb1D5的共有序列与S1蛋白87-PPQGMAW-93一致,mAb 6A12的共有序列与S1蛋白412-IQTRTEP-418一致。同源性分析发现,87-PPQGMAW-93在分属8个基因型32株IBV中变异性较大,特别是与CK/CH/LSC/99I-Type、Proventriculus-Type和TW-Type的差异性较大；而412-IQTRTEP-418在8个基因型中较保守,与JP-Type的差异较大。原核表达含有抗原表位的S1蛋白短肽pET-se1 (77aa-107aa)和pET-se2 (399aa-424aa),利用mAbs1D5和6A12分别对表达产物进行Western blot分析,结果显示,表达的融合蛋白pET-se 1可被mAb 1D5特异性识别,pET-se2可被mAb 6A12特异性识别,由此表明87-PPQGMAW-93和412-IQTRTEP-418为IBV Sczy3 S1蛋白的两个线性中和性B细胞抗原表位。该实验结果丰富了IBV S1蛋白的中和性单克隆抗体库,从分子水平上阐明了IBVS1蛋白的抗原结构,有利于进一步了解IBV S1蛋白抗原结构和功能的关系和遗传变异机制,为研究新型表位疫苗和表位诊断方法的建立夯实基础。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

３结果逡逑３．邋１邋ＩＢＶ邋Ｓ１基因生物信息学分析逡逑利用ＤＮＡＳｔａｒ中的Ｐｒｏ化ａｎ软件对Ｓｃｚｙ３邋Ｓ１蛋白进行生物信息学分析，结果如图２－１。逡逑从图中可看出，Ｓｃ巧３邋Ｓ１蛋白的二级结构用Ｇａｍｉｅｒ－Ｒｏｂｓｏｎ法和Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ法预测逡逑的结果有所不同，主要体现在Ｐ－折叠和转角区的结果上，总体来说，Ｓ１蛋白还是＾心｜３－逡逑折叠和转角区为主，含有较少ａ螺旋和卷曲区域；含有较多两亲性ａ螺旋、两亲性目折逡逑叠和柔性区域；蛋白的亲水性区域较多，抗原指数较高，集中在Ｈ个区域３４－２６８ａａ、逡逑３２８－４２０ａａ和４９７－５４０ａａ；表面可及性较高，有两个较高区域４０２－４％ａａ和５１５－５４０ａａ。逡逑ｆ逦Ｉ逦］逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ邋Ｉ逦Ｉ逦Ｉ邋口邋Ｓ；：邋５逡逑——逦？邋？？—逦？邋ｓ邋－逦＿邋－邋—逦—ｓ—逦？邋？邋？逦－＇ｓ＊逦？ｓ邋■逡逑．占．逦．Ａ。，；．逡逑Ａ逦ｒ邋Ｉ逦栻：！逦Ｉｌｌ逦？－．邋■邋■逡逑＝ＨＨＨｉｆＣＴｉｌ逦Ｂ邋ＩＢＢＩＢＨ邋Ｉ逦１邋ｉｒｓＧ．邋Ｒ与ｏｒ；邋－逡逑５逦１邋１邋１邋！邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋１邋ｉｉ逦ｔＳＷｌＩ邋ｊ邋！邋＞逦■！邋Ｉｌｌ邋ｉ邋Ｉ邋■逦＾逦：逡逑Ｔ邋Ｉ邋ＩＩ邋ＩＩ￣Ｍ３－０—Ｍ－ｉ逦ＨＨＨＨ￣ＩＨ—Ｗｉ－ｉ－ＨＩ￣ｌ－Ｈ￣ｌ－ｆｌ－Ｈ￣Ｈ邋0Ｔｌ，．巧古：万。－巧：ｊｒ逡逑了uk姜－S镁坼澹儒澹颍疂村澹赍寤璨倘ヒ

本文编号：2828814