橘小实蝇RNAi及其对RNAi的免疫耐受机制研究

发布时间：2020-10-08 20:55

　　 RNAi是由dsRNA引发的,靶向切割mRNA的高效特异的基因沉默技术。由于该技术具有高效性和便捷性,因此RNAi技术在包括基因功能研究、高通量靶标基因筛选、基因治疗、药物靶标预测和农业病虫害防治等领域均有广泛应用。RNAi实现方式包括显微注射、浸泡和饲喂法。虽然RNAi是一种广泛存在于多种真核生物并高度保守的机制,但是RNAi的应用仍然面对很多问题,例如包括许多双翅目昆虫在内的部分物种中RNAi难以实现和RNAi效应持续时间较短等。橘小实蝇的RNAi研究目前尚属空白。橘小实蝇是一种重要的农业害虫,为害250多种蔬果。本研究以橘小实蝇为研究对象,建立橘小实蝇的饲喂法RNAi体系；利用RNAi技术研究橘小实蝇spr基因和共生病毒功能；首次发现了橘小实蝇对RNAi的免疫耐受现象并阐述其机制。1.成功建立了橘小实蝇饲喂法RNAi体系。直接喂食靶标基因dsRNA和喂食表达靶标基因dsRNA的大肠杆菌均可以实现目的基因沉默。其中rpll9 dsRNA喂食组橘小实蝇rpll9基因表达量在喂食后第1天和第7天分别出现了89%和85%的下调。在表达rpll9 dsRNA大肠杆菌喂食组中,rpll9基因表达水平于第1天和第7天出现了30%的下调。在V-ATP-D dsRN A喂食组中,V-ATP-D基因表达水平在第4天出现了幅度为36%下调。在表达V-ATP-D dsRNA的大肠杆菌喂食组中,V-ATP-D基因表达水平在第4天出现了50%的下调。我们同时发现靶标基因在饲喂dsRNA和表达dsRNA的菌液后于第2天或第4天出现了上调dsRNA喂食组橘小实蝇rpll9基因表达量在喂食后第4天出现了3倍的上调。在表达V-ATP-D dsRNA的大肠杆菌喂食组中,V-ATP-D基因表达水平在第2天出现了1.6倍的上调。组织特异性检测结果表明饲喂法RNAi所引起的RNAi不局限于中肠,可以在头、生殖系统和脂肪体中观察到。其中,dsRNA喂食RNAi导致noa基因表达水平于生测后第2天在头、卵巢、精巢和脂肪体中分别出现了64%、23%、95%和89%的下调。连续喂食rpl19 dsRNA 12天后,rpll9基因表达水平恢复到正常,与egfp dsRNA喂食组无显著差异。同时,使用500ng/μl、100ng/μl和10 ng/μl rpl19 dsRNA进行橘小实蝇喂食RNAi实验均观察到rpll9基因表达水平于12天后恢复至正常水平。使用羽化后5天和羽化后10天橘小实蝇进行的rpl19 dsRNA喂食实验也观察到这一现象。上述结果表明这一现象与生测所用橘小实蝇的虫龄以及生测使用的dsRNA浓度无关。对F2代成虫RNAi效应检测结果表明亲代的RNAi干扰对子代没有影响。对子代初羽化成虫进行的rpll9 dsRNA喂食实验结果表明rpll9基因表达水平下调了66%,与亲代未经RNAi处理的F2代成虫喂食RNAi结果一致。2.我们首次发现橘小实蝇可以对RNAi产生免疫耐受并阐述了其机制。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi导致rpll9基因下调66%；在此基础上进行的第二次喂食rpll9 dsRNA的RNAi无法引起rpll9基因下调。结果表明第一次针对内源基因的RNAi可以使橘小实蝇对RNAi产生免疫耐受现象。同时这种免疫耐受现象是非基因特异的。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi同样使橘小实蝇对第二次喂食spr dsRNA的RNAi产生免疫,spr表达水平在第二次RNAi中不出现下调。1000ng/μl rpl19 dsRNA引起的橘小实蝇对RNAi的免疫耐受性持续20-30天；100 ng/μl和10 ng/μl rpl19 dsRNA引起的橘小实蝇对RNAi的免疫耐受性分别持续10-20天和5天,表明橘小实蝇对RNAi的免疫耐受性的持续时间和第一次RNAi中所使用的dsRNA浓度相关。通过巴弗洛霉素处理橘小实蝇肠道,我们发现橘小实蝇的dsRNA摄取是由胞吞机制调控的。荧光免疫染色研究结果表明在对RNAi免疫耐受的橘小实蝇中,dsRNA摄取机制受到了阻遏,dsRNA无法正常进入细胞。在对RNAi免疫耐受的橘小实蝇中,che、light、cog3、ap50和nina c等基因均出现了30%-60%的下调,表明其对RNAi的免疫耐受性是由胞吞机制的活性下降所引起的。这一结论也得到了高通量测序结果的支持。高通量测序发现参与细胞运输的chc、actinl、actin2和actin5等基因出现下调。而通过利用双氧水促进肌动蛋白形成可以解除橘小实蝇对RNAi的免疫耐受。5%的H202与100 ng/μl rpl19 dsRNA共喂食引起对RNAi免疫耐受的橘小实蝇中rpll9基因表达水平出现50%的下调。这些研究结果证实了胞吞机制受阻是橘小实蝇对RNAi产生免疫耐受现象的关键原因。3.通过上述建立的RNAi技术发现spr参与了橘小实蝇交配后抗氧化胁迫能力的改变。通过克隆获取橘小实蝇spr基因全长,该基因编码324个氨基酸。cDNA序列十分保守,与地中海实蝇spr相似度为86%(E值=0)。spr表达模式结果显示spr在中肠中表达量最高,其次为后肠和头部。spr在不同发育阶段的橘小实蝇中均有表达,其中在幼虫和蛹期表达水平最高。研究结果发现橘小实蝇交配后雌虫的抗氧化胁迫能力下降。在双氧水生测中,交配后的雌虫存活率明显低于未交配雌虫,生测开始后72小时的交配组雌虫存活率为9.4%,在同一时间点,未交配雌虫存活率为56.7%(p=0.017)。同时交配后TOR信号通路的rheb基因上调了88%、tor基因上调了28%。此外,TOR通路的关键效应基因s6k上调了54%,表明橘小买蝇对氧化胁迫敏感性上升；而通过显微注射spr dsRNA,成功敲除spr,使spr基因表达水平下调了75%后,橘小实蝇交配后抗氧化胁迫能力不变,TOR通路基因的表达水平也未发生变化。这些结果表明spr通过TOR通路参与了橘小实蝇交配后抗氧化胁迫能力的改变。4.利用RNAi技术研究橘小实蝇共生病毒的功能。根据DGE和转录组测序结果,我们鉴定了8个橘小实蝇共生病毒序列。其中contig1697、contig475、comp2791和comp11365编码双顺反子病毒科病毒的结构蛋白或者非结构蛋白。comp3227和comp 16524编码RdRp聚合酶,属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)。我们利用comp 11365病毒RdRp序列确认其分类地位为小RNA病毒目(Picomavirales)、双顺反子病毒科(Dicistroviridae)、蟋蟀麻痹病毒属(Cripavirus),并将其命名为Bdv-1。Bdv-1病毒主要分布于橘小实蝇中肠,其含量为生殖系统的3000倍。使用饲喂法干扰Bdv-1表达后,我们检测到橘小实蝇中肠中Bdv-1含量下调了48%。饲喂法干扰Bdv-1后,我们发现橘小实蝇中肠总菌群下降了54%左右。γ变形菌、拟杆菌和放线菌与egfp dsRNA对照组相比均出现了约50%的下调。α变形菌与厚壁菌在饲喂法干扰Bdv-1后与egfp dsRNA对照组无显著性差异。这些结果证明Bdv-1与肠道菌群数量相关。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S433
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1 RNAi的发现
    2 RNAi的分类和机制
        2.1 细胞自主型RNAi
        2.2 非细胞自主型RNAi
    3 RNAi机制的生理功能
    4 RNAi的应用现状及进展
    5 RNAi在昆虫中的应用
        5.1 RNAi在昆虫基因功能研究中的作用
        5.2 RNAi在害虫防治中的应用
            5.2.1 显微注射法RNAi在害虫防治中的应用
            5.2.2 饲喂法RNAi在害虫防治中的应用
            5.2.3 转基因作物RNAi在害虫防治中的应用
            5.2.4 滴注法RNAi在害虫防治中的应用
    6 目的及意义
第二章 橘小实蝇饲喂法RNAi体系建立
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 供试昆虫
            1.1.2 主要仪器设备
            1.1.3 常用缓冲液、培养基及抗生素的配制
            1.1.4 菌株和质粒
            1.1.5 主要试剂及试剂盒
        1.2 实验方法
            1.2.1 橘小实蝇总RNA提取
            1.2.2 简并引物和特异性引物设计
            1.2.3 rpl19和V-ATP-D基因克隆
            1.2.4 rpl19和V-ATP-D dsRNA表达和提取
            1.2.5 生测方法
            1.2.6 荧光定量PCR
            1.2.7 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 rpl19和V-ATP-D序列克隆及分析
            2.1.1 橘小实蝇总RNA提取
            2.1.2 目标基因扩增结果
            2.1.3 rpl19和V-ATP-D序列分析
        2.2 dsRNA表达载体构建及dsRNA提取
        2.3 菌液喂食可行性检测和dsRNA稳定性检测
        2.4 内参基因筛选以及荧光定量扩增效率确认
        2.5 dsRNA饲喂法和菌液饲喂法均可以下调靶标基因表达水平
        2.6 RNAi效应组织特异性分析
        2.7 长期喂食RNAi效应检测
        2.8 F2代橘小实蝇RNAi效应检测
        2.9 不同浓度rpl19 dsRNA喂食RNAi效应检测
        2.10 不同虫龄橘小实蝇成虫喂食RNAi效应检测
    3 讨论
第三章 基于RNAi技术的spr基因功能研究
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 供试昆虫
            1.1.2 主要仪器设备
            1.1.3 主要试剂及试剂盒
        1.2 实验方法
            1.2.1 总RNA提取
            1.2.2 spr基因全长克隆及序列分析
            1.2.3 荧光定量PCR
            1.2.4 生测方法
            1.2.5 RNAi研究spr功能
            1.2.6 数据分析
    2 结果及分析
        2.1 spr基因克隆及序列分析
        2.2 橘小实蝇spr表达谱分析
        2.3 橘小实蝇雌虫交配后TOR信号通路上调
        2.4 交配降低橘小实蝇雌虫抗氧化胁迫能力
        2.5 spr调控交配后雌虫抗氧化胁迫能力变化
    3 讨论
第四章 基于RNAi技术的橘小实蝇共生病毒功能研究
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 供试昆虫
            1.1.2 主要仪器设备
            1.1.3 主要试剂及试剂盒
        1.2 实验方法
            1.2.1 总RNA提取
            1.2.2 总DNA提取
            1.2.3 病毒序列注释
            1.2.4 Bdv-1 RNAi
            1.2.5 肠道细菌荧光定量PCR计数和菌落计数
            1.2.6 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 转录组测序发现8条病毒序列
        2.2 病毒片段的表达谱
        2.3 Bdv-1与橘小实蝇肠道微生物稳态有关
    3 讨论
第五章 橘小实蝇对RNAi的免疫耐受及其机理研究
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 供试昆虫
            1.1.2 主要仪器设备
            1.1.3 主要试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 dsRNA制备
            1.2.2 喂食生测方法
2O₂解除橘小实蝇对RNAi的免疫耐受实验'>            1.2.3 H₂O₂解除橘小实蝇对RNAi的免疫耐受实验
            1.2.4 数字基因表达谱
            1.2.5 显微注射
            1.2.6 cy3荧光标记dsRNA
            1.2.7 组织培养
            1.2.8 免疫荧光染色
            1.2.9 荧光定量PCR
            1.2.10 数据分析
    2 结果及分析
        2.1 喂食非靶标基因dsRNA的RNAi效应
        2.2 喂食靶标基因dsRNA引起橘小实蝇RNAi免疫耐受
        2.3 RNAi免疫耐受不具备基因特异性
        2.4 不同浓度靶标基因dsRNA的免疫耐受效果
        2.5 胞吞机制受阻导致橘小实蝇对RNAi免疫耐受
        2.6 免疫耐受橘小实蝇差异表达基因
        2.7 双氧水促进胞吞机制从而打破免疫耐受
    3 讨论
第六章 结论与展望
    1 结论
    2 创新点
    3 展望
参考文献
攻读学位期间发表的论文
致谢

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 付佑胜;赵桂东;潘建平;田世尧;王沫;;橘小实蝇引诱物质研究进展[J];安徽农业科学;2006年09期

2 崔俊霞;徐瑛;闻伟刚;陈先锋;张同心;;橘小实蝇快速检疫鉴定方法[J];昆虫知识;2006年05期

3 周国梁;印丽萍;李尉民;张卫东;;利用概率模型定量评估橘小实蝇传入我国的可能性[J];植物检疫;2006年S1期

4 周国梁;叶军;袁平;潘士华;;橘小实蝇在上海局部暴发成因分析[J];植物检疫;2006年S1期

5 杜迎刚;陈家骅;季清娥;何官榕;黄居昌;;橘小实蝇对蛋白和糖的反应[J];福建农林大学学报(自然科学版);2007年04期

6 杜迎刚;陈家骅;季清娥;;橘小实蝇个体食量测定[J];福建农林大学学报(自然科学版);2008年02期

7 伍丽芳;刘淑娴;;治橘小实蝇 春季最关键[J];农药市场信息;2009年06期

8 杜迎刚;李云玲;季清娥;;啤酒废酵母酶解生产橘小实蝇引诱蛋白研究[J];安徽农业科学;2012年03期

9 查国贤;郝建华;;橘小实蝇入侵苏州的风险评估[J];江苏农业科学;2012年07期

10 屈海学;孙静双;;北京地区橘小实蝇的生活习性观察[J];中国园艺文摘;2013年02期

相关会议论文 前10条

1 周密;王迎波;肖铁光;周社文;;橘小实蝇生物学及防治研究[A];依靠科技进步和创新加快发展现代农业学术研讨会优秀论文集[C];2009年

2 黄胜威;邱国强;李金甫;刘元明;杨长举;张宏宇;;橘小实蝇传入湖北的风险分析[A];生物入侵与生态安全——“第一届全国生物入侵学术研讨会”论文摘要集[C];2007年

3 高强;张宏宇;华红霞;蔡万伦;田世尧;杨长举;;橘小实蝇实验种群生物学研究[A];生物入侵与生态安全——“第一届全国生物入侵学术研讨会”论文摘要集[C];2007年

4 曾玲;陆永跃;林进添;梁广文;;橘小实蝇的防治策略和技术[A];科技创新与绿色植保——中国植物保护学会2006学术年会论文集[C];2006年

5 沈雪林;徐荣侠;蔡平;张国彪;徐建方;孙振军;查国贤;;苏州地区发生橘小实蝇危害[A];首届长三角园艺论坛论文集[C];2007年

6 周湾;施祖华;邱志刚;王建欣;钱军;林云彪;吴奕峰;吴玉兰;戚利潮;万华建;许凤仙;;浙江杭州市橘小实蝇的发生与监测[A];植物保护与现代农业——中国植物保护学会2007年学术年会论文集[C];2007年

7 陈力;杨文佳;豆威;王进军;;橘小实蝇酸性磷酸酯酶生化特性研究[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年

8 林珠凤;肖彤斌;芮凯;谢圣华;吉训聪;秦双;陈绵才;;土壤处理对橘小实蝇的防治效果[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年

9 陈连根;朱春刚;夏希纳;;上海地区橘小实蝇生物学特性初步研究[A];中国植物园（第十二期）[C];2009年

10 高强;张宏宇;华红霞;蔡万伦;田世尧;杨长举;;橘小实蝇幼虫人工饲料研究[A];生物入侵与生态安全——“第一届全国生物入侵学术研讨会”论文摘要集[C];2007年

相关重要报纸文章 前8条

1 省植保所 贺淑岚;掌握发生规律 防治橘小实蝇[N];湖南科技报;2007年

2 贝绍国邋崔俊霞;宁波空港截获橘小实蝇[N];中国国门时报;2008年

3 王丹 陈骏锋;苏州局科研项目获苏州市科技局立项[N];中国国门时报;2006年

4 记者 温海龙;十四国专家来榕“取经”[N];福州日报;2009年

5 梁炜;山东鸭梨输美不再需要冷处理[N];中国国门时报;2008年

6 徐瑛;王立红;归来勿带洋水果[N];中国国门时报;2003年

7 宪臣邋通讯员 玉林 全意;烟台鸭梨重获竞争力[N];烟台日报;2008年

8 本报记者 雷光美 通讯员 郭胜鑫 杨志慧 杨特团;绿色防控,现代农业制胜法宝[N];福建日报;2012年

相关博士学位论文 前4条

1 胡建峰;橘小实蝇监测、生物防治及蛋白铒剂应用机理[D];福建农林大学;2012年

2 李晓雪;橘小实蝇RNAi及其对RNAi的免疫耐受机制研究[D];华中农业大学;2015年

3 王洪秀;橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）成虫肠道细菌分子多态性分析及其功能研究[D];华中农业大学;2011年

4 耿军灵;阿里山潜蝇茧蜂大量饲养及对橘小实蝇的控制研究[D];福建农林大学;2009年

相关硕士学位论文 前10条

1 王旭;湖北武汉橘小实蝇的发生动态及入侵来源[D];华中农业大学;2010年

2 林志强;重庆市沙坪坝区橘小实蝇种群发生规律研究[D];西南大学;2015年

3 邹聪;inaC基因在橘小实蝇光响应中的功能研究[D];华中农业大学;2015年

4 王爱琳;PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小实蝇免疫及肠道微生物调控中的作用研究[D];华中农业大学;2015年

5 柳静;橘小实蝇精子发生相关基因功能研究[D];华中农业大学;2015年

6 胡黎华;寄主转换对橘小实蝇种群动态和抗氧化酶系的影响[D];西南大学;2011年

7 杨春花;影响橘小实蝇蛹色伴性遗传品系质量的因素[D];福建农林大学;2011年

8 高强;橘小实蝇人工饲料的研究[D];华中农业大学;2005年

9 高扬;橘小实蝇饲养方法的改进及田间防治[D];福建农林大学;2012年

10 杨莉莉;水解蛋白对橘小实蝇生理机制影响的研究[D];福建农林大学;2013年

本文编号：2832747