卵胞质注射转基因(CI-MGT)具有操作简单、胚胎损伤小和胚胎体外停留时间短等优点,结合体内受精胚胎和高效基因编辑技术,最近被广泛应用于转基因动物生产中。单精子胞质内注射转基因(ICSI-MGT)适于大片段外源基因转移,并能有效解决猪体外受精胚胎多精子受精等问题,特别适用于转基因猪的生产。广西地处高温高湿的亚热带地区,为优化此种环境下猪胚胎和转基因技术体系,本研究在优化猪卵母细胞体外成熟、激活及胚胎培养条件的基础上,系统探讨了体外受精及孤雌激活胚胎CI-MGT和ICSI-MGT的相关影响因素,并对CI-MGT体外受精胚胎及ICSI-MGT胚胎生产转基因猪可行性进行了研究。研究结果如下：1.探讨了成熟液和胚胎培养液组分对猪卵母细胞成熟及胚胎发育效果的影响。结果显示,成熟基础液为TCM-199核成熟率和胚胎发育效率显著高于NCSU-37和PZM-3(P0.05)。以TCM-199为成熟基础液,不加额外能量底物(PMt)的核成熟率和孤雌囊胚发育率分别为74.1土2.4%和29.3+1.3%,显著高于添加0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖(PMtsg)或0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖+0.1mg/mL谷氨酰胺(PMtsgg, P0.05)。在成熟液中添加10 IU/mL eCG+15 IU/mL hCG组的核成熟率和胚胎发育效率显著高于添加0.5μg/mL FSH+0.5μg/mLLH或0.5μg/mL FSH+10 UI/mL hCG。成熟液中添加50 ng/mL EGF+10 ng/mL IGF-I组囊胚率显著高于添加10 ng/mL EGF和不添加组(P0.05)。对猪卵母细胞体外成熟过程中核相变化研究显示,成熟培养38 h的核成熟率为57%(105/184),40 h为43%(82/189),42 h为48%(75/155),44 h为59%(208/354),46 h为70%(59/84),48 h为62%(51/82),50 h为74%(154/207)。在以PZM-3为基础液的胚胎培养液中添加0.277 mmol/L肌醇(PZMi),其囊胚率显著高于添加0.34 mmol/L柠檬酸钠(PZMc)或0.34 mmol/L柠檬酸钠+0.277 mmol/L肌醇(PZMci, P0.05);添加0.5 mg/mL透明质酸组的囊胚率显著高于未添加组(P0.05)；添加3 mg/mL BSA-FAF组的囊胚率显著高于添加BSA-V组(41.4士4.1%vs 36.7±3.8%,P0.05)。培养液中BSA浓度增加至5 mg/mL或在培养96 h后加入10%FBS的囊胚率和囊胚孵化率均有所增加,但差异不显著。添加50 ng/mL IGF-I的囊胚率和囊胚细胞数高于未添加组,但差异不显著。2.探讨了激活方法对猪卵母细胞孤雌胚胎发育效果的影响。结果显示,卵母细胞经5 μmol/L离子霉素(Ion)激活5 min后,再分别在含2 mmol/L6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP),5μg/mL细胞松弛素B (CB)+10放线菌酮(CHX),5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP,5μg/mL CB+10μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP培养4 h的囊胚率显著高于在10μg/mL CHX培养4 h的囊胚率(29.7±1.1%、29.8±1.2%、30.4±1.6%和30.2±2.7%vs 15.8土1.5%,P0.05),但四组间囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显著差异。当电脉电压为1.25KV/cm时3次电脉冲电激活的囊胚发育率显著高于2次电脉冲(P0.05),当电脉冲为3次时电场强度为0.80和1.00KV/cm的胚胎碎裂率显著低于1.20 KV/cm,且1.00 KV/cm组的囊胚率显著高于0.80和1.20 KV/cm组(P0.05)。卵母细胞电激活后分别用5μg/mL CB+10 μg/mL CHX,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP培养处理4 h的囊胚率(55.4±1.2%和50.4±2.9%)显著高于用2 mmol/L 6-DMAP (37.9±2.4%),5 μg/mL CB+10 μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP (36.9±3.1%)培养处理4 h的囊胚发育率,亦显著高于单纯电激活处理(40.7±1.7%)和Ion激活后用2 mmol/L 6-DMAP (30.6±0.8%)培养处理4 h的囊胚发育率(P0.05。电激活后,用5μg/mLCB培养处理4 h的囊胚率显著高于用5μg/mLCB培养处理4 h(54.0±4.1%vs 37.9±2.4%,P0.05),与7.5μg/mLCB组差异不显著,但7.5μg/mLCB组的ICM细胞数和ICM/TE均显著高于5 μg/mLCB组(P0.05)。对胚胎核型进行分析结果表明,电激活后用7.5μg/mL CB+10 μg/mL CHX培养处理4 h的囊胚细胞二倍体率显著高于单纯电激活处理组(84.6% vs 40.0%,P0.05)。3.研究了猪卵胞质内注射转基因的影响因素。孤雌激活卵胞质注射(PA-CI)的研究结果显示,注射外源RNA、外源RNA+1-4 U/μL RNA酶抑制剂对孤雌激活卵的囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显著影响,表明可同时注射外源RNA和RNA酶抑制剂。注射100 ng/μL EGFP-N1 DNA的孤雌囊胚阳性率显著高于50 ng/μL和空注组,但囊胚率显著低于其余两组(33.9士1.1%vs 46.4±2.1%和50.5±1.9%,P0.05)；注射100 ng/μL Talen-BMP15 RNA的囊胚率与50 ng/μL注射组和空注组差异不显著,表明注射DNA对胚胎毒性大于注射RNA。孤雌激活后5-18 h注射的囊胚率均显著低于注射后立刻激活或激活后立刻注射的囊胚率(P0.05)。注射EGFP-N1线性化DNA的囊胚阳性率显著高于环状DNA(15.8±1.4%vs11.7±1.0%,P0.05),但两者胚胎发育率差异不显著,并且外源RNA注射组的囊胚率普遍高于注射DNA载体。当采用体外受精卵进行胞质内注射时(IVF-CI),精卵孵育后5-18 h注射线性化EGFP-N1载体的囊胚率和囊胚细胞数差异均不显著,但5-6、8-9和11-12 h注射组胚胎阳性率显著高于14-15和17-18 h(12.6±0.6%,11.8土0.5%和13.6±0.6%vs 8.7±0.8%和6.5±1.0%,P0.05),表明外源DNA在猪雌雄原核形成期(约13 h)前注射的外源基因整合效率较高。注射40和50 ng/μL EGFP-N1 DNA组囊胚率显著高于100 ng/μL,与10、20、30ng/μL和空注组差异不显著,同时40、50和100 ng/pL组阳性率显著高于其余各组(P0.05)。IVF卵注射GDF8 Cas9 mRNA/sgRNA的囊胚率显著低于PA卵(13.7±0.8%vs 52.6+3.1%,P0.05),但注射IVF卵的胚胎基因突变效率显著高于注射PA卵(25.0% vs3.8%,P0.05),表明Cas9/sgRNA系统可以通过注射猪IVF卵对猪的基因组进行编辑。4.系统研究了猪单精子胞质内注射转基因的影响因素。结果显示,10和20 ng/μL EGFP-N1 DNA与精子共孵育的囊胚率显著高于50和100 ng/μL(33.8±2.4%和31.0±0.9% vs 24.4±2.7和16.1±0.8%,P0.05),但20ng/μL孵育组胚胎阳性率显著高于10ng/μL(30.5±1.5%vs 16.3±1.5,P0.05)。精子与外源基因孵育5、30和60 min囊胚率显著高于孵育24 h,但30和60 min组阳性率和囊胚阳性率显著高于5 min(P0.05)。采用不同冷冻液(DPBS、 BTS和mNIM)冷冻精子对ICSI-MGT胚胎发育率无显著影响,但精子孵育液DPBS+EDTA (10 mmol/L EDTA)的囊胚率显著高于DPBS(27.8±0.7%vs 22.2±1.6%, P0.05), mNIM (10 mmol/L EDTA+123.0 mmol/L KCl)组的囊胚率显著高于DPBS+EDTA组(33.2±1.3%vs 27.8±0.7%,P0.05),表明孵育液中的EDTA和K+对注射后的胚胎发育有影响。精子超声+冻融处理和NaOH处理的囊胚率显著高于鲜精、A23187、超声、冻融和三次冻融处理组,超声+冻融和NaOH处理组的胚胎外源基因阳性率亦显著高于鲜精和A23187处理组。此外,卵母细胞激活后注射超声+冻融和NaOH处理精子的囊胚率显著高于激活前注射组(35.7±2.4%vs 30.2+0.6%；34.5±0.3% vs28.5±0.9%,P0.05),表明精子破膜与激活影响ICSI-MGT胚胎的发育。卵母细胞激活后0-30 min注射的囊胚率显著低于60-90 min注射组,但阳性率和囊胚阳性率均显著高于60-90 min注射组。对ICSI后不同时间合子内的GSH含量分析显示,激活后0-30 min注射组的6 h合子GSH含量显著低于60-90 min注射组和孤雌激活组(3.22±0.06 vs 5.02±0.09和4.73±0.14,P0.05),而60-90 min注射组的6 h和12 h合子GSH含量与孤雌组均无显著差异。进一步原核分析发现,0-30 min注射组的雌雄双原核形成率显著高于60-90 min(56.9±3.7% vs 36.3±2.0%,P0.05),且0-30min注射组精子解聚率显著高于60-90min,表明延长激活以后的注射时间会造成更高的孤雌胚胎产生。采用不同外源基因载体(EGFP-N1、Anti-FMDV. PRL-EGFP和IFN-EGFP)的ICSI-MGT囊胚率差异不显著,但显著影响胚胎阳性率,其中EGFP-N1线性化载体阳性率显著高于环状载体(35.9±0.2%vs20.9±0.9%,P0.05),而Anti-FMDV RNAi载体阳性率和囊胚阳性率均显著低于其它载体(P0.05)。将Cas-GDF8、Anti-FMDV和EGFP-N1的ICSI-MGT胚胎移植入6头自然发情受体内,4头未见返情,其中7557号受体流产获得3头胎猪,7645号受体妊娠到期得到4头仔猪,对仔猪耳朵皮肤EGFP和Neo双基因进行PCR鉴定均显示阳性,表明应用优化的ICSI-MGT技术可以获得转基因猪后代。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S814
【文章目录】：摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
第一章 文献综述
1 卵母细胞成熟、激活与胚胎培养
1.1 卵母细胞成熟
1.2 卵母细胞激活
1.3 早期胚胎发育
2 卵胞质注射转基因
2.1 卵胞质注射研究进展
2.2 卵胞质注射转基因机理
2.3 卵胞质注射影响因素
3 单精子胞质内注射转基因
3.1 精子载体法
3.2 单精子胞质内注射
4 本论文的研究意义
第二章 猪卵母细胞体外成熟与胚胎培养影响因素研究
摘要
前言
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.2 仪器与设备
1.3 试剂配制
1.4 试验方法
1.5 试验设计
1.6 数据统计分析
2 试验结果
2.1 猪卵母细胞体外成熟影响因素研究
2.2 猪胚胎培养影响因素研究
3 分析与讨论
3.1 猪卵母细胞体外成熟影响因素研究
3.2 猪胚胎培养影响因素研究
4 结论
第三章 猪卵母细胞孤雌激活方法研究
摘要
前言
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.2 仪器与设备
1.3 试剂配制
1.4 试验方法
1.5 试验设计
1.6 数据统计分析
2 试验结果
2.1 猪卵母细胞化学激活方法的初步研究
2.2 猪卵母细胞电激活方法的初步研究
2.3 猪卵母细胞电激活联合化学激活方法的初步研究
3 分析与讨论
3.1 猪卵母细胞化学激活方法的初步研究
3.2 猪卵母细胞电激活方法的初步研究
3.3 猪卵母细胞电激活联合化学激活方法的初步研究
4 结论
第四章 猪卵胞质注射转基因影响因素研究
摘要
前言
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.2 仪器与设备
1.3 试剂配制
1.4 试验方法
1.5 试验设计
1.6 数据统计分析
2 试验结果
2.1 孤雌激活和IVF方法的完善
2.2 孤雌卵胞质注射转基因方法的初步研究
2.3 受精卵胞质注射转基因方法的初步研究
3 分析与讨论
3.1 孤雌激活和IVF方法的完善
3.2 孤雌卵胞质注射转基因方法的初步研究
3.3 受精卵胞质注射转基因方法的初步研究
4 结论
第五章 猪单精子胞质内注射转基因影响因素研究
摘要
前言
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.2 仪器与设备
1.3 试剂配制
1.4 试验方法
1.5 试验设计
1.6 数据统计分析
2 试验结果
2.1 不同激活方法对猪ICSI胚胎发育的影响
2.2 不同外源基因浓度对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
2.3 精子与外源基因孵育时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
2.4 不同精子冷冻液和孵育液对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
2.5 不同精子处理方法和激活方法对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
2.6 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
2.7 激活后精子注射时间对不同发育时间合子内谷胱甘肽含量的影响
2.8 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎原核形成的影响
2.9 不同外源基因载体对ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
2.10 单精子卵胞质注射胚胎的体内发育
3 分析与讨论
3.1 不同激活方法对猪ICSI胚胎发育的影响
3.2 不同外源基因浓度对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
3.3 精子与外源基因孵育时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
3.4 不同精子冷冻液和孵育液对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
3.5 精子处理和激活对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
3.6 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
3.7 不同外源基因载体对ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响
3.8 单精子卵胞质注射胚胎的体内发育
4 结论
参考文献
附图
致谢
攻读学位期间发表论文情况
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本文编号：
2860367
