西甜瓜转基因抗病毒研究

发布时间：2017-04-05 02:06

  本文关键词：西甜瓜转基因抗病毒研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：西甜瓜是我国重要的葫芦科作物,其栽培面积和消费总量位居世界蔬菜水果前列。病毒病是葫芦科作物生产中存在的重大问题,严重影响着西瓜和甜瓜的产量与品质。病毒病大面积爆发时,导致产量降低,甚至绝产。通过转基因手段,将病毒的相关基因通过农杆菌介导的遗传转化方法导入西瓜和甜瓜,探讨病毒与葫芦科寄主作物之间的关系,创制新的抗病毒葫芦科作物新种质,具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究的主要结果如下:1.优化了西瓜的组织培养体系。西瓜离体继代培养过程中,西瓜组培苗容易黄化,随着继代时间的延长,逐渐衰老死亡。本研究发现,Fe盐对黄化的影响最大,将Fe-EDTA浓度加倍,组培苗生长健壮,可以持续继代。西瓜继代苗根数少,清洗琼脂时,容易断根。将伸长至2-3cm的西瓜小植株,切下作为接穗,嫁接到两片子叶完全展开的砧木上,不仅能提高成活率,而且西瓜植株生长健壮,果实提早成熟一个月。解决了西瓜再生苗黄化和移栽成活率低的问题,为西瓜转基因技术奠定了好的基础。2.建立了西瓜的遗传转化体系。西瓜种子在1/2 MS培养基上萌发4-5d,子叶颜色从黄色刚刚转变为绿色作为外植体,切除生长点的子叶基端接种在培养基MS+BA 1.0mg/L预培养5d,农杆菌侵染20 min,共培养5d。转基因材料通过PCR和Southern杂交检测,初步验证基因整合到西瓜基因组。3.人工小RNA能够结合病毒RNA并降解其基因组,对病毒产生抗性。本研究利用人工小RNA技术设计的人工小RNA,可以识别黄瓜花叶病毒CMV 2a/2b基因部分编码区对CMV病毒进行基因表达抑制。转化西瓜材料,接种后,转基因株系通过ELISA检测,初步验证表达人工小RNA的转基因西瓜材料对CMV病毒具有抗性。4.建立了甜瓜遗传转化体系。甜瓜子叶颜色由黄色转为绿色时作为外植体,距下胚轴1-2mm处,切下子叶基端在培养基MS+BA 1.2mg/L中预培养5d,与农杆菌侵染20min,共培养3d。通过PCR和Southern杂交检测,以及GUS染色,进一步证明甜瓜转基因技术稳定。5.具有发卡结构的植物表达载体导入植株,在植物体内表达能够诱导基因沉默,协同发挥抗病机制。本研究构建ZYMV、WMV和CMV的3个外壳蛋白基因嵌合片段(CWZ)反向重复植物表达载体,利用农杆菌介导法转化常规甜瓜品种,将三种病毒的基因片段整合到甜瓜基因组,为探讨转基因葫芦科作物通过RNA沉默实现抗病毒提供了新的方法。本研究为葫芦科作物转基因技术提供了一些新的手段和方法,获得了转基因抗病毒的西瓜和甜瓜材料,具有一定的应用价值。
【关键词】：西瓜 甜瓜 人工小RNA 病毒 GUS RNA沉默
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S65
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 缩略词表13-14
• 第一章 文献综述14-39
• 1.1 西甜瓜病毒病研究概况14-22
• 1.1.1 蛋白质介导的病毒抗性16-17
• 1.1.2 RNA介导的病毒抗性17-21
• 1.1.3 非病毒来源的抗性21-22
• 1.1.4 抗病毒基因工程存在的问题22
• 1.2 西瓜抗病毒基因工程研究进展22-32
• 1.2.1 西瓜组织培养研究进展23-27
• 1.2.1.1 种子贮存时间影响丛生芽再生24
• 1.2.1.2 基因型和苗龄的影响24
• 1.2.1.3 外植体类型的影响24-25
• 1.2.1.4 激素组合对西瓜分化的影响25-26
• 1.2.1.5 培养条件的影响26
• 1.2.1.6 西瓜组织培养中出现的问题26-27
• 1.2.2 转基因技术在西瓜育种上的应用27-32
• 1.2.2.1 筛选标记基因对转化的影响28-29
• 1.2.2.2 不同的农杆菌菌株对转化的影响29
• 1.2.2.3 预培养对转化的影响29-30
• 1.2.2.4 侵染时间和浓度对转化的影响30
• 1.2.2.5 共培养对转化的影响30
• 1.2.2.6 农杆菌介导西瓜遗传转化的主要问题30-32
• 1.3 甜瓜抗病毒基因工程研究进展32-38
• 1.3.1 甜瓜组织培养体系研究进展33-35
• 1.3.1.1 基因型33
• 1.3.1.2 外植体33-34
• 1.3.1.3 子叶苗龄34
• 1.3.1.4 植物激素34
• 1.3.1.5 培养条件34-35
• 1.3.2 甜瓜转基因技术研究进展35-38
• 1.4 转基因对西甜瓜抗病性的改良和展望38-39
• 第二章 西瓜转基因抗病毒研究39-70
• 2.1 前言39-40
• 2.2 材料和方法40-47
• 2.2.1 植物和病毒材料40
• 2.2.2 菌株和质粒40
• 2.2.3 人工mi RN A植物表达载体构建40
• 2.2.4 西瓜再生40-42
• 2.2.4.1 外植体的获得40-41
• 2.2.4.2 苗龄对诱导丛生芽的影响41
• 2.2.4.3 不同部位外植体诱导丛生芽的影响41
• 2.2.4.4 激素水平对丛生芽再生率的影响41
• 2.2.4.5 液体和固体培养基对丛生芽诱导的影响41
• 2.2.4.6 KH_2PO_4水平对诱导丛生芽的影响41-42
• 2.2.4.7 Fe-EDTA水平对再生芽黄化的影响42
• 2.2.5 西瓜遗传转化42-47
• 2.2.5.1 Kan抗性的影响42-43
• 2.2.5.2 预培养时间43
• 2.2.5.3 侵染时间43
• 2.2.5.4 共培养时间43
• 2.2.5.5 转基因西瓜植株DNA提取43-44
• 2.2.5.6 转基因西瓜植株PCR阳性检测44
• 2.2.5.7 Southern杂交44-46
• 2.2.5.8 病毒接种攻毒试验46
• 2.2.5.9 ELISA检测CMV病毒积累情况46-47
• 2.3 结果与分析47-62
• 2.3.1 培养基对西瓜种子萌发的影响47-48
• 2.3.2 不同苗龄诱导丛生芽的影响48-49
• 2.3.3 子叶块部位对丛生芽诱导的影响49-50
• 2.3.4 激素组合对外植体丛生芽的影响50-51
• 2.3.5 固体和液体培养基对再生芽的影响51-52
• 2.3.6 KH_2PO_4水平对丛生芽诱导的影响52-53
• 2.3.7 Fe-EDTA水平对子叶黄化的影响53-55
• 2.3.8 Kan敏感性测定55-57
• 2.3.8.1 Kan处理子叶块浓度筛选55-56
• 2.3.8.2 Kan处理种子浓度筛选56-57
• 2.3.9 预培养时间对遗传转化丛生芽诱导的影响57-58
• 2.3.10 侵染时间对遗传转化丛生芽诱导的影响58
• 2.3.11 共培养时间对遗传转化丛生芽诱导的影响58-59
• 2.3.12 转基因西瓜植株嫁接成活情况59-60
• 2.3.13 转基因西瓜植株PCR检测结果60
• 2.3.14 转基因西瓜植株Southern blot检测结果60-61
• 2.3.15 转基因西瓜植株抗病毒试验61-62
• 2.4 讨论62-68
• 2.4.1 基本培养基对西瓜种子萌发的影响62-63
• 2.4.2 苗龄对西瓜再生的影响63
• 2.4.3 外植体部位对西瓜再生的影响63-64
• 2.4.4 KH2PO4对西瓜丛生芽诱导的影响64
• 2.4.5 Fe-EDTA对丛生芽黄化的影响64-65
• 2.4.6 不同激素组合对西瓜再生的影响65-66
• 2.4.7 抗生素浓度筛选66
• 2.4.8 预培养对抗性芽分化的影响66-67
• 2.4.9 共培养时间对抗性芽分化的影响67
• 2.4.10 转基因西瓜抗病毒的稳定性67-68
• 2.5 小结68-70
• 第三章 甜瓜转基因抗病毒研究70-92
• 3.1 前言70-71
• 3.2. 材料和方法71-76
• 3.2.1 植物和病毒材料71
• 3.2.2 菌株和质粒71
• 3.2.3 CWZ RNAi植物表达载体构建71-72
• 3.2.4 甜瓜遗传转化72-74
• 3.2.4.1 激素浓度对甜瓜外植体诱导丛生芽再生的影响73
• 3.2.4.2 甜瓜不同外植体诱导丛生芽73-74
• 3.2.4.3 甜瓜子叶和种子对Kan的敏感性试验74
• 3.2.4.4 预培养时间的影响74
• 3.2.4.5 侵染时间的影响74
• 3.2.4.6 共培养时间的影响74
• 3.2.5 转基因甜瓜植株DNA提取74-75
• 3.2.6 转基因甜瓜植株的PCR检测75
• 3.2.7 Southern杂交75
• 3.2.8 GUS染色75-76
• 3.3 结果与分析76-85
• 3.3.1 激素浓度对甜瓜子叶诱导丛生芽的影响76-77
• 3.3.2 激素浓度对甜瓜叶片诱导丛生芽的影响77-78
• 3.3.3 不同甜瓜子叶部位的影响78-79
• 3.3.4 预培养时间的研究79-80
• 3.3.5 侵染时间的影响80-81
• 3.3.6 共培养时间的影响81
• 3.3.7 甜瓜对kan的敏感性试验81-83
• 3.3.8 转基因T0代甜瓜叶片GUS测定83-84
• 3.3.9 PCR检测CWZ嵌合基因整合情况84-85
• 3.3.10 Southern进一步检测CWZ基因整合结果85
• 3.4 讨论85-89
• 3.5 小结89-92
• 参考文献92-102
• 个人简介102-103
• 致谢103-105

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 王慧中,赵培洁,徐吉臣,赵怀,张红生;转WMV-2外壳蛋白基因西瓜植株的病毒抗性[J];遗传学报;2003年01期

2 黄学森;牛胜鸟;王锡民;于嘉林;赵福兴;王生有;翟光明;蔡晓雨;师范生;曹永刚;许艳;郑芳;王小红;金霞;;转基因抗病毒病四倍体西瓜的培育[J];中国瓜菜;2007年06期

3 黄学森，焦定量，那丽;西瓜子叶离体培养获得再生植株[J];中国西瓜甜瓜;1994年03期

  本文关键词：西甜瓜转基因抗病毒研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：286274