CsMYB60对原花青素生物合成及灰霉病相关基因CsWRKY10的调控作用
发布时间：2020-10-31 18:39
黄瓜(Cucumis sativus)是深受人们喜爱的一种世界性蔬菜,具有很高的经济价值。我国是目前世界上黄瓜种植规模和产量最大的国家。因此,改善黄瓜品质,提高其抗性,实现黄瓜的优质、高效生产至关重要。本实验室前期以两个黄瓜自交系RNS8(白刺品种)和RNS9(黑刺品种)为材料,通过转录组和代谢组联合分析,揭示了黄瓜黑刺中含有黄酮醇化合物,并将定位区间内的一个R2R3-MYB转录因子CsMYB60定为B(Black spine)候选基因。然而黑刺分离所得的黄酮醇化合物的颜色并不是黑色的,说明黑刺中除黄酮醇之外还含有其他代谢物。因此,黄瓜黑刺中代谢物的种类和其生物合成的调控机制,CsMYB60是否为B基因以及该基因的功能都需进一步研究。本文通过相关生理生化试验,鉴定出黄瓜黑刺中含有原花青素物质,并解析了CsMYB60基因调控黄瓜原花青素合成的分子机制以及该基因在抗病性方面的生物学功能。具体研究结果如下:1.通过DMACA化学组织染色法和高效液相色谱质谱联用法鉴定黄瓜黑刺中含有原花青素物质。2.测序结果表明,22个不同黑白刺黄瓜自交系中CsMYB60基因序列存在多态性。与RNS9中CsMYB60基因的序列相比,其中5个白刺自交系的等位基因中均含有一个SNP,另外9个白刺自交系的等位基因中有一个大片段的插入。同时,实时荧光定量PCR分析表明黄瓜黑刺自交系中CsMYB60基因的表达量均显著高于白刺自交系。3.实时荧光定量PCR分析表明,在黄瓜果刺的不同发育时期,RNS9中CsMYB60与原花青素合成途径相关基因的表达量均显著高于RNS8。同时,运用基因枪转化系统和高效液质联用系统证明了分别过表达CsMYB60和Cs4CL可以诱导白刺中积累原花青素。表明CsMYB60通过调控Cs4CL促进黄瓜黑刺中原花青素的合成。4.测序结果分析表明,RNS8中CsMYB60基因的内含子区域插入了一个转座元件—CsMULE(Mutator-like element)。同时,McrBC酶切法和重亚硫酸盐测序法证明,RNS8中CsMYB60启动子区域甲基化程度高于RNS9。表明在RNS8中,CsMYB60内含子区域转座子的插入可能影响了其启动子的甲基化水平。5.与WT相比,CsMYB60过表达株系的叶片中总叶绿素和类胡萝卜素的含量显著降低,果实中VC和可溶性糖的含量显著增加且多种挥发性香气物质的含量都显著升高,其中最具黄瓜果实特征性风味的反,顺-2,6-壬二烯醛的含量变化最为显著。表明,过表达CsMYB60提高了黄瓜的果实品质。6.接种灰霉病菌后,CsMYB60过表达株系的病斑面积约为WT的两倍,且茉莉酸和H_2O_2的含量显著低于WT。表明过表达CsMYB60通过减少茉莉酸和H_2O_2的含量降低了黄瓜对灰霉病的抗性。7.通过黄瓜子叶瞬时表达系统,筛选出CsWRKY50、CsWRKY10、CsWRKY47三个可能参与到CsMYB60调控黄瓜响应灰霉病菌过程的基因。进一步通过人工接种病原菌发现,CsWRKY10基因表达量受灰霉病菌诱导最为强烈,且在CsWRKY10启动子中发现了两个MYB蛋白结合的顺式作用元件。同时,酵母单杂交实验证明,CsMYB60可以直接结合CsWRKY10的启动子。表明CsWRKY10很可能作为CsMYB60的下游基因调控黄瓜对灰霉病的抗性。8.通过农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系得到CsWRKY10过表达植株,人工接种灰霉病菌后发现,与WT相比,转基因株系的病斑面积显著增加,H_2O_2和O_2~-的含量显著降低。利用光学显微镜对灰霉病菌侵染WT和转基因植株的过程进行观察,发现接种8 h后,转基因株系上有个别孢子开始萌发,而WT上的孢子均没有萌发;接种10 h后,WT的孢子部分萌发,而转基因植株上的孢子几乎全部萌发且芽管显著伸长;随着侵染时间的增加,相同时间下CsWRKY10过表达株系上菌丝的蔓延程度明显高于WT。表明过表达CsWRKY10减少植株中ROS积累,促进灰霉病菌孢子萌发及菌丝伸长,增加对灰霉病的敏感性。9.接种灰霉病菌后,与WT相比,CsWRKY10过表达株系中茉莉酸的含量显著降低;茉莉酸介导的抗病途径的关键基因CsMYC2表达量显著上升,CsPDF1.2表达量显著下降,而水杨酸信号途径的关键基因CsICS及CsPR1的表达量均显著升高。表明在受到灰霉病菌侵染后,CsWRKY10参与激活了水杨酸信号通路,但是抑制了茉莉酸介导的抗病信号途径。10.CsWRKY10可以被活体营养型病原菌—靶斑病菌所诱导;并且接种病原菌后,CsWRKY10过表达株系的病斑面积显著小于WT。表明过表达CsWRKY10提高了黄瓜对靶斑病的抗性。本研究揭示了CsMYB60基因的多重功能。过表达CsMYB60正调控黄瓜果刺中原花青素的合成,并通过增加果实中VC、可溶性糖和挥发性物质的含量来提高黄瓜果实品质;并且CsMYB60直接调控CsWRKY10基因的表达,减少ROS的含量,同时抑制茉莉酸的合成及其介导的抗病信号途径,从而降低黄瓜对灰霉病的抗性。以上结果说明了生物中基因的多效性,同时也为今后通过分子设计育种改良黄瓜的品质和抗病性提供了一定的理论基础。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S436.412.13
【部分图文】：
原花青素特异途径包括无色花青素还原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)和花青素还原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)两条途径。无色花青素还原酶可以直接将无色花青素催化成2,3-反式黄烷-3-醇(2,3-trans-flavan-3-ol,catechin,儿茶素),主要包括儿茶素C和没食子儿茶素GC(194)。花青素还原酶可以催化花青素生成2,3-顺式黄烷-3-醇(2,3-cis-flavan-3-ol,epicatechm,表儿茶素),主要包括儿茶素EC和表没食子儿茶素EGC(Yuan et al.,2012)。儿茶素和表儿茶素是原花青素的单体,最终聚合形成原花青素。1.2.1.2原花青素合成的分子调控机制
植物中MYB转录因子在N端均含有一段约51~52个氨基组成的MYB结构域。MYB结构域折叠成螺旋-转角-螺旋(HTH)的形式与DNA大沟结合(Riechmann et al.,2000;Lipsick,1996),而MYB蛋白中均含有1~3个串联且不完全重复的MYB结构域(R1、R2和R3)。根据MYB蛋白中该结构域的个数,将其分为4类:单一的MYB结构域(R1/R2)亚类;含有两个MYB结构域的R2R3MYB亚类;含有三个MYB结构域的R1R2R3MYB亚类;含有四个MYB结构域的4RMYB亚类(刘守梅等,2012;Dubos et al.,2010;图2)。其中,最小的亚家族是4R-MYB,成员均含有4个R1/R2重复序列(图2),例如拟南芥的At3g18100基因。R2R3MYB亚类成员数目是最多的,参与到了控制细胞分化、次生代谢调节、应答激素刺激和抵御病原菌侵染等过程中(陈俊和王宗阳,2002)。1.2.2.2 MYB转录因子功能研究进展
茉莉酸不仅可以直接抑制病原菌的生长,在植物抵御灰霉病菌的过程中,茉莉酸更主要的是作为一种信号物质,激活抗病途径,诱导产生病程相关蛋白以及其他抗菌物质。JA信号模块主要由以下三部分组成:F-box蛋白、CORONATIN INSENSITIVE1(COI1)、Cullin1和Skp1-like1形成的具有功能性的Skp-Cullin-F-box(SCF)E3泛素连接酶复合物(Du et al.,2017);转录抑制因子JAZ(jasmonate-ZIM domain)蛋白(Yan et al.,2007);JA通路的关键调控因子MYC2(Zhai et al.,2013)。正常情况下,JAZ蛋白与MYC2结合并抑制其转录活性。当植物受到病原体侵染时,JA水平升高导致SCFCOI1复合物识别JAZ蛋白并使其泛素化,进而被26S蛋白酶体选择性降解,解除了JAZ蛋白对转录激活因子MYC2转录活性的抑制,从而激活JA应答基因的表达,增强抗病性。前人研究结果表明,番茄中茉莉酸不敏感突变体(jai1)的灰霉病斑大小是野生型的3倍。SlMYC2通过调控病原菌应答基因正向调控植株对灰霉病的抗性,相反SlMYC2-RNAi植株对灰霉病的敏感性显著高于WT(Du et al.,2017;图3)。在拟南芥中,ANAC019和ANAC055通过转录调控JA诱导的防御基因VSP1和LOX2的表达参与JA介导的防卫反应。anac019 anac055双突变体中VSP1和LOX2的表达水平降低导致植株对B.cinerea的敏感性增强(Bu et al.,2005)。在抵抗病原菌方面,不同植物激素信号途径之间往往存在着连接和交叉,相互协同或相互拮抗,形成精细而复杂的信号调控网络。茉莉酸调控寄主对灰霉病菌的抗性也不是一个简单的线性途径,而是与其他信号途径相互作用共同调节的结果(Devoto and Turner,2005)。在拟南芥中,ERF1基因对灰霉病抗性的调控依赖于茉莉酸和乙烯信号通路(Lorenzo et al.,2003)。ERF1过表达植株中防御响应基因PDF1.2的表达增强,进而提高对灰霉病的抗性(Berrocal-Lobo et al.,2002)。与ERF1一样,ORA59在茉莉酸/乙烯介导的植物对B.cinerea的防御响应中也起重要作用(Zarei et al.,2011),过表达ORA59可以激活PDF1.2的表达,增强植物对B.cinerea的抗性(Pre et al.,2008)。以上结果表明,ERF1和ORA59是植物抵抗B.cinerea反应中茉莉酸和乙烯信号传导途径的交叉点,这也为茉莉酸和乙烯两种激素相互作用提供了证据。同时水杨酸会通过其信号途径的下游基因抑制ORA59蛋白的积累,说明水杨酸与茉莉酸/乙烯存在拮抗作用(Van der Does et al.,2013)。WRKY33基因在植物对B.cinerea的防御反应中起正调控的作用。wrky33突变体对B.cinerea感病性增强,这与突变体中水杨酸响应基因PR-1、PR-5和PAD4的强烈表达以及茉莉酸调控基因PDF1.2的表达降低相一致(Zheng et al.,2006),WRKY33可能作为水杨酸和茉莉酸相互拮抗的中间点发挥作用。此外,脱落酸对植物抗灰霉病的影响与B.cinerea侵染的阶段及组织有关,有脱落酸缺陷的sitinen番茄突变体和脱落酸响应因子ABI5的突变体植株均对灰霉病有显著抗性(Asselbergh et al.,2007)。同时,脱落酸诱导番茄中转录因子AIM1正向调节早期对B.cinerea的防卫反应(Abuqamar et al.,2009)。
【相似文献】
本文编号：2864345
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S436.412.13
【部分图文】：
原花青素特异途径包括无色花青素还原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)和花青素还原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)两条途径。无色花青素还原酶可以直接将无色花青素催化成2,3-反式黄烷-3-醇(2,3-trans-flavan-3-ol,catechin,儿茶素),主要包括儿茶素C和没食子儿茶素GC(194)。花青素还原酶可以催化花青素生成2,3-顺式黄烷-3-醇(2,3-cis-flavan-3-ol,epicatechm,表儿茶素),主要包括儿茶素EC和表没食子儿茶素EGC(Yuan et al.,2012)。儿茶素和表儿茶素是原花青素的单体,最终聚合形成原花青素。1.2.1.2原花青素合成的分子调控机制
植物中MYB转录因子在N端均含有一段约51~52个氨基组成的MYB结构域。MYB结构域折叠成螺旋-转角-螺旋(HTH)的形式与DNA大沟结合(Riechmann et al.,2000;Lipsick,1996),而MYB蛋白中均含有1~3个串联且不完全重复的MYB结构域(R1、R2和R3)。根据MYB蛋白中该结构域的个数,将其分为4类:单一的MYB结构域(R1/R2)亚类;含有两个MYB结构域的R2R3MYB亚类;含有三个MYB结构域的R1R2R3MYB亚类;含有四个MYB结构域的4RMYB亚类(刘守梅等,2012;Dubos et al.,2010;图2)。其中,最小的亚家族是4R-MYB,成员均含有4个R1/R2重复序列(图2),例如拟南芥的At3g18100基因。R2R3MYB亚类成员数目是最多的,参与到了控制细胞分化、次生代谢调节、应答激素刺激和抵御病原菌侵染等过程中(陈俊和王宗阳,2002)。1.2.2.2 MYB转录因子功能研究进展
茉莉酸不仅可以直接抑制病原菌的生长,在植物抵御灰霉病菌的过程中,茉莉酸更主要的是作为一种信号物质,激活抗病途径,诱导产生病程相关蛋白以及其他抗菌物质。JA信号模块主要由以下三部分组成:F-box蛋白、CORONATIN INSENSITIVE1(COI1)、Cullin1和Skp1-like1形成的具有功能性的Skp-Cullin-F-box(SCF)E3泛素连接酶复合物(Du et al.,2017);转录抑制因子JAZ(jasmonate-ZIM domain)蛋白(Yan et al.,2007);JA通路的关键调控因子MYC2(Zhai et al.,2013)。正常情况下,JAZ蛋白与MYC2结合并抑制其转录活性。当植物受到病原体侵染时,JA水平升高导致SCFCOI1复合物识别JAZ蛋白并使其泛素化,进而被26S蛋白酶体选择性降解,解除了JAZ蛋白对转录激活因子MYC2转录活性的抑制,从而激活JA应答基因的表达,增强抗病性。前人研究结果表明,番茄中茉莉酸不敏感突变体(jai1)的灰霉病斑大小是野生型的3倍。SlMYC2通过调控病原菌应答基因正向调控植株对灰霉病的抗性,相反SlMYC2-RNAi植株对灰霉病的敏感性显著高于WT(Du et al.,2017;图3)。在拟南芥中,ANAC019和ANAC055通过转录调控JA诱导的防御基因VSP1和LOX2的表达参与JA介导的防卫反应。anac019 anac055双突变体中VSP1和LOX2的表达水平降低导致植株对B.cinerea的敏感性增强(Bu et al.,2005)。在抵抗病原菌方面,不同植物激素信号途径之间往往存在着连接和交叉,相互协同或相互拮抗,形成精细而复杂的信号调控网络。茉莉酸调控寄主对灰霉病菌的抗性也不是一个简单的线性途径,而是与其他信号途径相互作用共同调节的结果(Devoto and Turner,2005)。在拟南芥中,ERF1基因对灰霉病抗性的调控依赖于茉莉酸和乙烯信号通路(Lorenzo et al.,2003)。ERF1过表达植株中防御响应基因PDF1.2的表达增强,进而提高对灰霉病的抗性(Berrocal-Lobo et al.,2002)。与ERF1一样,ORA59在茉莉酸/乙烯介导的植物对B.cinerea的防御响应中也起重要作用(Zarei et al.,2011),过表达ORA59可以激活PDF1.2的表达,增强植物对B.cinerea的抗性(Pre et al.,2008)。以上结果表明,ERF1和ORA59是植物抵抗B.cinerea反应中茉莉酸和乙烯信号传导途径的交叉点,这也为茉莉酸和乙烯两种激素相互作用提供了证据。同时水杨酸会通过其信号途径的下游基因抑制ORA59蛋白的积累,说明水杨酸与茉莉酸/乙烯存在拮抗作用(Van der Does et al.,2013)。WRKY33基因在植物对B.cinerea的防御反应中起正调控的作用。wrky33突变体对B.cinerea感病性增强,这与突变体中水杨酸响应基因PR-1、PR-5和PAD4的强烈表达以及茉莉酸调控基因PDF1.2的表达降低相一致(Zheng et al.,2006),WRKY33可能作为水杨酸和茉莉酸相互拮抗的中间点发挥作用。此外,脱落酸对植物抗灰霉病的影响与B.cinerea侵染的阶段及组织有关,有脱落酸缺陷的sitinen番茄突变体和脱落酸响应因子ABI5的突变体植株均对灰霉病有显著抗性(Asselbergh et al.,2007)。同时,脱落酸诱导番茄中转录因子AIM1正向调节早期对B.cinerea的防卫反应(Abuqamar et al.,2009)。
【相似文献】
相关博士学位论文 前2条
1 刘梦雨;CsMYB60对原花青素生物合成及灰霉病相关基因CsWRKY10的调控作用[D];山东农业大学;2020年
2 李佳林;CsMYB60调控黄瓜类黄酮生物合成的分子机制[D];山东农业大学;2020年
本文编号：2864345
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/2864345.html
