菊芋悬浮细胞中菊糖及酚类物质的诱导

发布时间：2020-11-01 10:50

　　 菊芋(Helianthus tuberosus)是菊科(Asterceae)向日葵属的多年生草本植物,块茎富含的菊糖为工业果糖的重要来源,叶片、块茎的提取物及分泌物具有抗细菌、抗真菌及抗癌活性。菊芋具有很强的抗逆能力,在土壤改良、荒漠治理及水土保持方面也体现重要的生态价值,因此菊芋已成为具有经济和生态双重价值潜力的重要工业作物。本文通过植物组织培养技术获得了菊芋悬浮培养细胞,并以此为研究对象,研究了茉莉酸甲酯、水杨酸、壳聚糖、酵母提取物、绿色木霉、AgNO36种诱导子对菊糖(含量、产量及聚合度)和酚类物质(总酚、组分)的诱导。(1)通过对菊芋叶片、茎节及块茎3种外植体在愈伤组织诱导率、形态及干重的比较,结合NAA与6-BA和KT的激素组合筛选,确定了菊芋愈伤组织诱导的最佳外植体为茎节,培养基为MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA。进一步,通过接种量、继代原液保留量、蔗糖浓度、氮源添加等条件的优化,建立了菊芋细胞悬浮培养体系：培养基为MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L脯氨酸+1.0 mg/L谷氨酰胺,蔗糖30g/L,接种量4 g/100 mL液体培养基,继代原液保留量为20 mL。获得了最佳生长曲线：0-4天为迟滞期,6-18天为对数生长期,之后为稳定期。(2)6种诱导子对菊芋悬浮细胞中菊糖的诱导效果依次为：茉莉酸甲酯(250μmol/L)AgNO3 (10μmol/L)水杨酸(75 μmol/L壳聚糖(40 mg/L)绿色木霉(90 mg/L)酵母提取物(0.25 mg/L),相应的菊糖含量增加了1.43、1.05、0.93、0.76、0.44、0.18倍,相应的菊糖产量分别提高了2.09、3.60、1.26、1.76、1.06、0.09倍。6种诱导子均显著提高菊芋悬浮细胞中低聚合度(聚合度Dp 2-20)菊糖的比例。茉莉酸甲酯对Dp 2-8的菊糖诱导效果显著,尤其诱导Dp6菊糖比例由2.17%增加到29.15%。水杨酸显著诱导增加Dp 2-17菊糖的比例,特别是Dp 2-4菊糖比例分别由8.16%、6.79%、7.17%提高到20.86%、14.79%、18.53%。壳聚糖对Dp4菊糖诱导效果最为显著,比例由0.51%增加到56.42%。酵母提取物及绿色木霉显著增加了Dp3和Dp4菊糖的比例,Dp3菊糖比例分别增加到50.78%(对照28.04%)、38.12%(对照22.77),Dp4菊糖比例分别增加到58.83%(对照1.78%)、51.22%(对照32.57%)。AgN03增加了Dp 3-12菊糖比例,其中Dp7菊糖效果最显著,由0.01%增加到11.15%。结合菊芋悬浮细胞中菊糖含量以及低聚合度菊糖比例确定了6种诱导子的最佳处理浓度和时间为：茉莉酸甲酯(250 μmol/L)6天、水杨酸(75 μmol/L)3天、壳聚糖(40 mmg/L)6天、酵母提取物(0.25 mg/L)12天、绿色木霉(90 mg/L)3天、AgN03(10μmol/L)3天。(3)6种诱导子对菊芋悬浮细胞中总酚诱导效果依次为酵母提取物(1.0 mg/L)AgNO3 (5 μmol/L)绿色木霉(90 mg/L)水杨酸(100 μmol/L)茉莉酸甲酯(300 μmol/L)壳聚糖(80 mg/L),相应的总酚含量增加到2.14、1.91、1.85、1.63、1.56、1.17倍。最佳浓度诱导时间为茉莉酸甲酯12天(2.61倍)、水杨酸6天(1.92倍)、酵母提取物3天(1.19倍),其余3种诱导子随诱导时间增加细胞中总酚含量显著降低。6种诱导子对菊芋悬浮细胞中14种酚类物质含量均具有显著影响。茉莉酸甲酯诱导其中5种酚类物质含量增加10倍以上,同比其他诱导子4-羟基香豆素含量最多增加了59.69倍。相比其他诱导子水杨酸诱导其中7种酚类物质(阿魏酸、水杨酸、3-羟基肉桂酸、儿茶素、没食子酸、东莨菪内酯及原儿茶酸)含量增加最为显著,分别增加了159.22、106.47、45.14、15.20、7.80、7.06、5.89倍。壳聚糖诱导其中6种酚类物质含量增加10倍以上,咖啡酸和芥子酸含量显著增加了98.88倍、79.50倍。酵母提取物显著增加了表儿茶素(45.04倍)及绿原酸(37.45倍)的含量,同比4-羟基苯甲酸及槲皮素含量诱导也最显著。绿色木霉及AgN03虽然诱导增加了菊芋悬浮细胞中各种酚类物质含量,但诱导效果低于其他4种诱导子。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S632.9
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 菊芋
    1.2 菊芋的生物活性物质
        1.2.1 菊糖
        1.2.2 酚类和萜类化合物
    1.3 植物组织培养
        1.3.1 组织培养影响因素
        1.3.2 植物悬浮细胞培养
        1.3.3 菊芋悬浮细胞培养
    1.4 植物生物活性物质的诱导
        1.4.1 诱导子
        1.4.2 植物生物活性物质的诱导研究现状
    1.5 本试验研究的目的及意义
2 菊芋悬浮细胞培养体系建立
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 愈伤组织的诱导
        2.2.2 菊芋悬浮细胞培养体系的建立及优化
        2.2.3 菊芋悬浮细胞生长曲线
    2.3 讨论
    2.4 本章小结
3 菊芋悬浮细胞中生物活性物质含量检测方法
    3.1 材料与方法
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 菊糖及酚类物质测定方法
        3.1.5 数据分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 菊糖含量测定
        3.2.2 菊糖聚合度测定
        3.2.3 酚类物质提取
        3.2.4 酚类物质含量及抗氧化性测定
        3.2.5 14种酚类物质的LC-MS分析
        3.2.6 14种酚类物质的UPLC分析
    3.3 讨论
    3.4 本章小结
4 菊芋悬浮细胞中菊糖的诱导
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 试剂
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 诱导浓度对菊芋悬浮细胞生物量的影响
        4.2.2 诱导浓度对菊芋悬浮细胞中菊糖含量、产量及聚合度的影响
        4.2.3 诱导时间对菊芋悬浮细胞生物量的影响
        4.2.4 诱导时间对菊芋悬浮细胞中菊糖含量、产量及聚合度的影响
    4.3 讨论
    4.4 本章小结
5 菊芋悬浮细胞中酚类物质的诱导
    5.1 材料与方法
        5.1.1 试验材料
        5.1.2 试剂
        5.1.3 主要仪器
        5.1.4 方法
    5.2 结果与分析
        5.2.1 诱导子对菊芋悬浮细胞总酚的影响
        5.2.2 诱导浓度对菊芋悬浮细胞中14种酚类物质含量的影响
        5.2.3 诱导时间对菊芋悬浮细胞中14种酚类物质含量的影响
        5.2.4 诱导子对菊芋悬浮细胞总酚抗氧化性的影响
    5.3 讨论
    5.4 本章小结
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢

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本文编号：2865431