动物源抗菌肽对肠道免疫及物理屏障的影响及其机制研究

发布时间：2020-11-07 08:10

　　 针对畜禽养殖过程中抗生素的长时间、高剂量使用所引发的诸如超级耐药细菌的产生、食品安全隐患及环境污染等系列问题,研究新型抗生素替代品非常重要。抗菌肽因其安全性高、抗菌谱广及不易产生耐药性等特点引起了人们的高度关注。最近研究表明,抗菌肽的功能不仅局限于抗菌,其在动物体内更为重要的是发挥免疫调节及屏障保护功能,因此本研究以开发新型抗生素替代品为目的,从研究动物源抗菌肽对缓解肠道炎症和改善肠道物理屏障功能的角度出发,在本课题组前期研究工作的基础上筛选出两种抗菌活性强、细胞毒性低的动物源抗菌肽C-BF与pBD2,首先以DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎为模型,系统研究了抗菌肽C-BF与pBD2对肠道炎症的缓解作用及对肠上皮物理屏障功能的改善效果,进一步通过体外试验研究了抗菌肽缓解肠道炎症及改善肠道物理屏障的途径,旨在揭示其发挥上述功能的分子机制。主要研究结果如下：试验一、抗菌肽对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠肠道炎症影响的研究本试验通过建立葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型,通过表观症状、机体炎症水平及结肠炎症水平三个方面研究了抗菌肽C-BF和pBD2对DSS诱导小鼠肠道炎症的影响：(1)DSS诱导小鼠肠炎模型的建立及抗菌肽对DSS诱导小鼠表观症状的影响：本研究通过3%的DSS成功诱导小鼠溃疡性结肠炎模型,通过观察记录发现,在诱导阶段通过注射抗菌肽C-BF和pBD2,小鼠精神状况得到明显好转,且肛门出血症状得到有效改善,从评价疾病活动指数的三个指标(日增重变化、粪便成型度、粪便隐血情况)的统计结果来看,随着诱导天数的增加,注射抗菌肽组小鼠的体重变化趋势与对照组接近,同时从对粪便成型度观察及粪便隐血阳性检测结果表明,DSS诱导组小鼠粪便成型度评分显著高于对照组(p0.05),隐血阳性个体数逐日增加,而注射抗菌肽组小鼠上述两指标均发生明显好转。上述结果表明在DSS诱导引发的溃疡性结肠炎模型中,注射两种抗菌肽对小鼠表观症状的改善起着积极作用,为后续深入的在分子层面开展研究提供了依据；(2)抗菌肽对小鼠全身炎症水平的影响：在全血中主要免疫细胞比例方面,通过流式细胞术测定全血中主要免疫细胞的比例,结果表明DSS显著下调了全血中巨噬细胞和B、T淋巴细胞的比例,而注射抗菌肽C-BF和pBD2后,均能在不同程度上提高上述主要免疫细胞的比例,说明其在一定程度上对机体先天及后天免疫功能的恢复具有促进作用；在血清中炎性细胞因子表达方面：通过ELISA法测定小鼠血清中各细胞因子的浓度,结果表明DSS显著提高了血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10的浓度(p0.05),而注射抗菌肽C-BF与pBD2后,血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10的浓度均显著降低(p0.05),结果提示上述两种抗菌肽可通过下调炎性因子的分泌缓解机体炎症；(3)抗菌肽对小鼠结肠炎症水平的影响：在结肠炎性细胞浸润方面,通过免疫组化对小鼠结肠炎性细胞进行标记,检测各组结肠组织炎性细胞浸润程度。结果表明DSS诱导后炎性细胞浸润程度显著增加(p0.05),而注射抗菌肽C-BF和pBD2后,显著改善了结肠组织炎性细胞浸润状况(p0.05),说明上述两种抗菌肽可通过抑制入侵结肠组织炎性细胞的数量减缓肠道炎症；在小鼠结肠nCRAMP表达丰度方面：通过免疫荧光技术对小鼠体内抗菌肽mCRAMP进行标记,测定不同组别间mCRAMP的表达丰度。结果表明DSS处理显著提高了结肠mCRAMP的表达丰度,而注射抗菌肽C-BF与pBD2后,mCRAMP的表达丰度与DSS组比显著降低,结合前人的研究发现mCRAMP的表达水平与肠道炎症状态呈高度正相关,此研究结果提示上述两种抗菌肽对结肠炎症水平具有明显缓解作用；在结肠炎性相关酶活方面：通过对结肠组织INOS及COX-2的浓度进行测定,结果表明DSS诱导组INOS及COX-2的浓度显著高于对照组(p0.05),而注射抗菌肽C-BF与pBD2后,结肠中INOS及COX-2的浓度显著下调(p0.05),结果表明上述两种抗菌肽可通过下调炎性相关酶浓度的方式缓解肠道炎症。试验二、抗菌肽缓解肠道炎症的机制研究在试验一发现抗菌肽C-BF与pBD2对改善DSS诱导小鼠表观症状及缓解肠道炎症有一定效果的基础上,本研究进一步从炎性相关信号通路炎症水平、巨噬细胞吞噬功能及巨噬细胞极化功能三个方面对其缓解肠道炎症的机制进行探讨：(1)抗菌肽缓解DSS诱导小鼠肠炎的信号通路研究：在缓解肠道炎症信号通路方面,通过western-blot对小鼠结肠组织炎性相关信号通路的磷酸化水平进行分析,结果表明在DSS诱导下,会引起与炎性因子分泌相关的信号NF-κB(p65)及c-jun的磷酸化水平显著提高(p0.05),而加入抗菌肽C-BF和pBD2处理后能显著降低NF-κB(p65)的磷酸化水平(p0.05),但是对c-jun的磷酸化水平却无明显影响,上述结果提示抗菌肽C-BF和pBD2可能是通过抑制NF-κB(p65)而非c-jun的磷酸化水平缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症；在小鼠巨噬细胞炎性因子表达水平方面：体外构建RAW264.7细胞炎症模型,通过ELISA法测定培养上清中TNF-α、PGE2及NO的浓度,结果表明抗菌肽C-BF和pBD2均可显著降低LPS导致的RAW264.7细胞分泌上清中TNF-α、 PGE2及NO浓度的异常升高(p0.05),同时利用qRT-PCR测定促炎因子的基因表达水平,结果表明与LPS组比较,抗菌肽C-BF和pBD2预处理组显著下调了RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、FN-γ、IL-8和MCP-1的基因表达水平(p0.05),上述结果说明抗菌肽C-BF和pBD2均可显著降低RAW264.7细胞的炎症水平；在缓解小鼠巨噬细胞炎症信号通路方面：利用western-blot对炎性相关信号通路的磷酸化水平进行分析,结果表明抗菌肽C-BF和pBD2预处理小鼠巨噬细胞,可显著降低LPS引起的炎性信号因子AKT、IκB-α和NF-κB磷酸化水平的升高,上述结果再次证明了抗菌肽C-BF和pBD2可通过抑制NF-κB相关信号通路的磷酸化水平缓解炎症。在上述研究发现抗菌肽C-BF和pBD2具有缓解炎症的功能及其可能的信号通路后,进一步研究了其是否对正常巨噬细胞具有调控功能及其可能的分子机制：(2)抗菌肽对猪巨噬细胞吞噬功能的影响及其机制：在对猪巨噬细胞吞噬功能的影响方面,通过流式细胞术对不同浓度(12.5、25、50μg/ml)抗菌肽处理猪巨噬细胞后的吞噬功能进行检测,研究结果表明抗菌肽C-BF和pBD2对猪巨噬细胞的吞噬功能均具有促进作用,其中抗菌肽C-BF具有剂量依赖效应；在促进猪巨噬细胞吞噬功能的机制方面：通过RNAi技术干扰猪巨噬细胞表面TLR2/4,再用抗菌肽进行处理后检测其吞噬功能,研究结果表明TLR2和TLR4干扰后,抗菌肽C-BF和pBD2对猪巨噬细胞吞噬功能的促进作用明显减弱,说明上述两种抗菌肽促进猪巨噬细胞吞噬功能可能是通过TLR2/4信号途径介导,上述结果提示抗菌肽缓解肠道炎症的另一机制可能是通过增强巨噬细胞对细菌的吞噬功能,减少感染肠道病原菌数量实现；(3)抗菌肽协同诱导猪巨噬细胞极化分型的作用：在猪巨噬细胞极化分型的影响方面,通过在诱导猪巨噬细胞向不同分型极化的过程中,加入抗菌肽共同诱导,分别利用western-blot和qRT-PCR检测影响巨噬细胞极化分型关键信号因子的磷酸化水平和不同分型巨噬细胞表面特征分子的基因表达水平,研究结果表明抗菌肽C-BF和pBD2均可通过激活STAT-6的磷酸化水平协同诱导猪巨噬细胞向M2型分化,同时也发现其协同诱导后上调了M2型巨噬细胞表面特征分子的基因表达水平,且抗菌肽C-BF的协同诱导效果优于抗菌肽pBD2。该结果从影响巨噬细胞分型的角度揭示了抗菌肽C-BF和pBD2缓解炎症的又一分子机制。试验三、抗菌肽对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠肠道物理屏障的保护功能研究广义的肠道屏障功能包括免疫屏障、物理屏障、化学屏障及微生物屏障,每个独立的屏障功能相互影响,联系十分密切。上述肠道炎症的发生可定义为免疫屏障功能异常,因此我们在关注抗菌肽对肠道免疫屏障影响的同时,也开展了其对肠道物理屏障的作用研究。本研究从肠道形态、肠道电生理变化及结肠上皮凋亡与紧密连接蛋白表达三个方面研究了抗菌肽对小鼠肠道物理屏障的保护功能：(1)抗菌肽对DSS致小鼠肠道形态损伤的影响：在结肠形态方面,采集小鼠肠道样品,制作HE染色切片对结肠形态进行观察,从肠道形态来看,与对照组相比,DSS诱导组小鼠结肠上皮受到严重的破坏,肠绒毛结构杂乱无章,且用肉眼已完全无法分辨其肠上皮粘膜层结构,同时粘膜下层水肿严重,加入抗菌肽C-BF和pBD2处理组小鼠结肠绒毛结构与DSS组相比发生明显改变,肠绒毛间边界清晰,具有完整的粘膜层形态结构,且粘膜下层水肿情况有了明显改善；结果提示抗菌肽可明显改善DSS导致的结肠上皮形态破坏；(2)抗菌肽对DSS诱导小鼠结肠电生理学变化的影响：在上述发现抗菌肽对DSS致小鼠结肠形态破坏具有明显改善的基础上,开展了其对DSS诱导小鼠结肠电生理学变化的影响。在结肠通透性高低方面：通过采样前4h注射FITC-dextran,采样后收集小鼠血清,用酶标仪测定FITC-dextran浓度,结果表明,与正常对照组比较,DSS诱导组小鼠血清中FITC-dextran浓度显著提高(p0.05),而注射C-BF后血清中FITC-dextran浓度与DSS组比较显著下调(p0.05),注射pBD2后血清中FITC-dextran浓度有下降的趋势,上述结果提示抗菌肽在不同程度上降低了DSS致结肠通透性增加；在结肠跨上皮电阻值方面：通过Ussing champer测定各组结肠粘膜跨上皮电阻值变化,结果表明DSS诱导组小鼠跨上皮电阻值明显低于40Ω,而不同抗菌肽处理组小鼠跨上皮膜电阻值均稳定在40Ω以上,结果提示抗菌肽对于维持结肠电生理学的稳定状态具有积极作用；(3)抗菌肽对结肠上皮细胞凋亡及紧密连接蛋白表达的影响：在研究发现抗菌肽可缓解DSS致结肠跨上皮电阻值下降的基础上,对各组间结肠上皮的凋亡程度进行分析。在结肠上皮细胞凋亡方面：通过TUNNEL试剂盒对结肠上皮凋亡情况进行分析,结果表明DSS诱导的小鼠其结肠上皮细胞凋亡指数显著增加(p0.05),而在DSS的诱导过程中,加入抗菌肽C-BF和pBD2处理的组别,其结肠上皮细胞凋亡指数与单独用DSS诱导组相比显著降低(p0.05),结果说明抑制结肠上皮凋亡水平可能是缓解跨上皮电阻值下降,维持肠道形态正常的原因之一；在紧密连接蛋白及黏蛋白表达方面：通过qRT-PCR检测各组结肠组织紧密连接蛋白及黏蛋白的基因表达水平,结果表明：与对照组相比,DSS处理组显著降低了紧密连接蛋白和黏蛋白的表达水平(p0.05),而加入抗菌肽处理的组别,不同程度的提高了紧密连接蛋白的表达水平,其中抗菌肽C-BF的促进效果优于pBD2。上述研究结果提示抗菌肽可通过改善紧密连接蛋白的表达,维持肠道物理屏障功能正常。试验四、抗菌肽保护肠道物理屏障的机制研究在上述研究发现抗菌肽C-BF与pBD2对改善肠道物理屏障具有明显效果的基础上本研究从肠细胞单层跨上皮电阻值、细胞间紧密连接结构及肠细胞形态三个方面对其保护肠道物理屏障的机制进行探讨：(1)抗菌肽对DSS致肠上皮细胞单层跨膜电阻值降低的影响：在Caco-2细胞单层跨膜电阻值方面,本研究模拟体内肠上皮组织结构特点,体外培养入Caco-2细胞至单层分化状态,用DSS进行细胞模型的建立,研究结果表明DSS单独处理组Caco-2细胞单层跨上皮电阻值显著低于对照组(p0.05),而抗菌肽C-BF和pBD2预处理的组别,其跨上皮电阻值与对照组接近；(2)抗菌肽对Caco-2细胞间紧密连接结构及紧密连接蛋白表达的影响：在Caco-2细胞间紧密连接结构方面,通过透射电镜对培养的Caco-2细胞单层紧密连接结构进行观察,研究结果表明DSS可使本来结构完整清晰的紧密连接结构被破坏,而用抗菌肽C-BF和pBD2预处理的组别,其紧密连接结构完整,说明维持紧密连接结构的完整性是抗菌肽缓解DSS致跨上皮电阻值降低的机制之一；在紧密连接蛋白的表达方面：通过western-blot和qRT-PCR分析抗菌肽对DSS致紧密连接蛋白表达下调的影响,结果表明与正常对照组比较,DSS处理组ZO-1、Claudin-1、Occludin的表达水平均显著低于对照组(p0.05),而加入抗菌肽预处理后,上述三个紧密连接蛋白的表达水平均有不同程度升高,提示抗菌肽可促进紧密连接蛋白的表达维持紧密连接结构完整性；(3)抗菌肽对单个上皮细胞形态的影响：在单个Caco-2细胞形态方面,通过扫描电镜观察抗菌肽对DSS致单个Caco-2细胞形态破坏的影响,结果表明DSS处理组Caco-2细胞表面微绒毛形态受到严重破坏,呈光滑状,从多细胞视野中甚至可以看到一些细胞已经发生瓦解或呈现碎片样,而在DSS刺激前加入抗菌肽C-BF和pBD2预处理的各组,其Caco-2细胞表面微绒毛形态与对照组接近,提示抗菌肽对单个上皮细胞的正常生长同样具有保护作用。综上所述,本研究通过DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型发现抗菌肽C-BF和pBD2具有显著缓解肠道炎症和改善肠道物理屏障的功能,并揭示了其缓解炎症和改善屏障功能的内在机制,研究结果提示上述两种抗菌肽具有替代抗生素治疗人类或动物肠炎的药用前景。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S859.79
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
    1 抗菌肽的研究历史
        1.1 抗菌肽的来源
        1.2 抗菌肽的分类
            1.2.1 Cathelicidins家族抗菌肽
            1.2.2 Defensins家族抗菌肽
                1.2.2.1 α-Defensins
                1.2.2.2 β-Defensins
                1.2.2.3 θ-Defensins
    2 抗菌肽的生物学功能及其作用机制
        2.1 抗菌肽的杀菌功能及其机制研究
            2.1.1 桶板模型
            2.1.2 地毯模型
            2.1.3 环形（圆环）-气孔模型
            2.1.4 胞内作用机制
            2.1.5 细菌抗性机制
        2.2 抗菌肽的免疫调控功能及其机制研究
            2.2.1 宿主防御肽的抗感染特性
            2.2.2 抗菌肽对免疫细胞的作用机制
                2.2.2.1 抗菌肽对免疫细胞的作用受体及相关信号通路
                2.2.2.2 抗菌肽对免疫细胞分化功能的影响
                2.2.2.3 抗菌肽选择性改变炎症反应
                2.2.2.4 抗菌肽作为免疫佐剂发挥作用
        2.3 抗菌肽的屏障功能及其机制研究
            2.3.1 LL-37调节血管再生及细胞生长机制
    3 抗菌肽与炎症疾病
        3.1 抗菌肽与肠道炎症疾病的关系
            3.1.1 机体自身抗菌肽分泌与克罗恩病的关系
            3.1.2 机体自身抗菌肽分泌与溃疡性结肠炎的关系
        3.2 抗菌肽保护肠道炎症疾病的研究
            3.2.1 Denfesin家族抗菌肽与肠道炎症疾病
            3.2.2 Cathelicidin家族抗菌肽与肠道炎症疾病
            3.2.3 杀菌通透性增加蛋白（BPI）与肠道炎症疾病
            3.2.4 人工合成抗菌肽与肠道炎症疾病
        3.3 抗菌肽与脓毒血症
            3.3.1 LPS与抗菌肽结合的分子基础
            3.3.2 抗菌肽抑制LPS诱导的炎症反应的机制
                3.3.2.1 识别并结合循环系统中的LPS分子
                3.3.2.2 从LBP上转移LPS分子至膜CD14上
                3.3.2.3 通过CD14-LPS复合物激活TLR4和其他信号分子
                3.3.2.4 抗菌肽调控TLR4下游信号转导通路缓解LPS炎症
            3.3.3 内源及合成抗菌肽在人与小鼠败血症中的作用
    4 本研究的目的意义与主要内容
        4.1 目的意义
        4.2 主要内容
第二章 抗菌肽对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠免疫保护功能研究
    1.1 腹腔注射抗菌肽的吸收代谢规律研究
        1.1.1 实验材料及仪器
            1.1.1.1 抗菌肽
            1.1.1.2 实验动物
            1.1.1.3 其他实验材料及仪器
        1.1.2 实验方法
        1.1.3 实验结果
        1.1.4 讨论
    1.2 UC小鼠模型的建立及抗菌肽对表观症状的影响
        1.2.1 实验材料及仪器
            1.2.1.1 抗菌肽及葡聚糖硫酸钠
            1.2.1.2 实验动物
            1.2.1.3 其他实验试剂及仪器
        1.2.2 实验方法
        1.2.3 实验结果
        1.2.4 讨论
    1.3 抗菌肽对肠道免疫功能的调节作用
        1.3.1 抗菌肽对外周血中巨噬细胞,B,T淋巴细胞,NK细胞比率的影响
            1.3.1.1 实验材料及仪器
            1.3.1.2 实验方法
            1.3.1.3 实验结果
                1.3.1.3.1 抗菌肽对外周血中巨噬细胞比例的影响
                1.3.1.3.2 抗菌肽对外周血中B淋巴细胞比例的影响
                1.3.1.3.3 抗菌肽对外周血中T淋巴细胞比例的影响
                1.3.1.3.4 抗菌肽对外周血中NK细胞比例的影响
        1.3.2 抗菌肽对DSS诱导小鼠回肠,结肠内源抗菌肽（mCRAMP）表达的影响
            1.3.2.1 实验材料及仪器
            1.3.2.2 实验方法
            1.3.2.3 实验结果
                1.3.2.3.1 抗菌肽对DSS诱导小鼠回肠mCRAMP表达的影响
                1.3.2.3.2 抗菌肽对DSS诱导小鼠结肠mCRAMP表达的影响
        1.3.3 抗菌肽对血清及结肠组织中炎性细胞因子表达的影响
            1.3.3.1 实验材料及仪器
            1.3.3.2 实验方法
            1.3.3.3 实验结果
                1.3.3.3.1 抗菌肽对血清中细胞因子分泌水平的影响
                1.3.3.3.2 抗菌肽对结肠组织细胞因子基因表达水平的影响
        1.3.4 抗菌肽对结肠处炎性细胞浸润的影响
            1.3.4.1 实验材料及仪器
            1.3.4.2 实验方法
            1.3.4.3 实验结果
                1.3.4.3.1 抗菌肽对结肠嗜中性粒细胞入侵的影响
                1.3.4.3.2 抗菌肽对结肠巨噬细胞入侵的影响
                1.3.4.3.3 抗菌肽对结肠免疫细胞特异性分泌酶活水平的影响
        1.3.5 抗菌肽对结肠炎性相关酶浓度的影响
            1.3.5.1 实验材料及仪器
            1.3.5.2 实验方法
            1.3.5.3 实验结果
                1.3.5.3.1 抗菌肽对结肠炎性相关酶（INOS和COX-2）浓度的影响
        1.3.6 抗菌肽对回盲端及血清中免疫球蛋白水平的影响
            1.3.6.1 实验材料与仪器
            1.3.6.2 实验方法
            1.3.6.3 实验结果
                1.3.6.3.1 抗菌肽对回肠末端sIgA浓度的影响
                1.3.6.3.2 抗菌肽对血清IgA、IgG、IgM分泌水平的影响
        1.3.7 讨论
第三章 抗菌肽在免疫调节方面的初步机制研究
    1.1 抗菌肽缓解炎症的信号通路研究
        1.1.1 抗菌肽缓解结肠炎小鼠的信号通路研究
            1.1.1.1 实验材料和仪器
            1.1.1.2 实验方法
            1.1.1.3 实验结果
        1.1.2 抗菌肽缓解小鼠RAW264.7细胞炎症的信号通路研究
            1.1.2.1 实验材料与仪器
            1.1.2.2 实验方法
            1.1.2.3 实验结果
                1.1.2.3.1 不同浓度抗菌肽对巨噬细胞毒性的影响
                1.1.2.3.2 不同浓度LPS对巨噬细胞毒性的影响
                1.1.2.3.3 抗菌肽对LPS诱导的Raw264.7细胞炎症反应的影响
                1.1.2.3.4 抗菌肽缓解LPS诱导细胞炎症反应的信号通路研究
        1.1.3 讨论
    1.2 抗菌肽对猪巨噬细胞吞噬功能的影响及其机制研究
        1.2.1 抗菌肽对猪巨噬细胞吞噬功能的影响
            1.2.1.1 实验材料及仪器
            1.2.1.2 实验方法
            1.2.1.3 实验结果
        1.2.2 抗菌肽对猪巨噬细胞干扰TLR2/4后吞噬功能的影响
            1.2.2.1 TLR2/4干扰的猪巨噬细胞系建立
                1.2.2.1.1 实验材料与仪器
                1.2.2.1.2 实验方法
                1.2.2.1.3 实验结果
            1.2.2.2 抗菌肽对TLR2/4干扰后猪巨噬细胞吞噬功能的影响
                1.2.2.2.1 实验材料与仪器
                1.2.2.2.2 实验方法
                1.2.2.2.3 实验结果
        1.2.3 讨论
    1.3 抗菌肽对TLR4干扰后巨噬细胞炎性因子表达的影响
        1.3.1 实验材料与仪器
        1.3.2 实验方法
        1.3.3 实验结果
        1.3.4 讨论
    1.4 抗菌肽协同诱导猪巨噬细胞的极化作用研究
        1.4.1 实验材料
        1.4.2 实验方法
        1.4.3 实验结果
        1.4.4 讨论
    1.5 抗菌肽对小鼠巨噬细胞表面共刺激分子的影响
        1.5.1 实验材料及仪器
        1.5.2 实验方法
        1.5.3 实验结果
        1.5.4 讨论
第四章 抗菌肽对肠道屏障的功能研究
    1.1 抗菌肽C-BF与pBD2对UC肠炎小鼠的屏障保护研究
        1.1.1 抗菌肽对肠道通透性的影响研究
            1.1.1.1 实验材料及仪器
            1.1.1.2 实验方法
            1.1.1.3 实验结果
        1.1.2 抗菌肽C-BF与pBD2对回肠和结肠上皮形态的影响
            1.1.2.1 实验材料及仪器
            1.1.2.2 实验方法
            1.1.2.3 实验结果
        1.1.3 抗菌肽C-BF与pBD2对结肠上皮凋亡水平的影响
            1.1.3.1 实验材料及仪器
            1.1.3.2 实验方法
            1.1.3.3 实验结果
        1.1.4 抗菌肽C-BF与pBD2对结肠紧密连接蛋白表达的影响
            1.1.4.1 实验材料及仪器
            1.1.4.2 实验方法
            1.1.4.3 实验结果
        1.1.5 讨论
    1.2 抗菌肽C-BF对LPS致大鼠肠炎的屏障保护及治疗效果研究
        1.2.1 抗菌肽C-BF对空肠上皮形态的作用效果
            1.2.1.1 实验材料及仪器
            1.2.1.2 实验方法
            1.2.1.3 实验结果
        1.2.2 抗菌肽C-BF对大鼠空肠上皮超微结构的影响
            1.2.2.1 实验材料及仪器
            1.2.2.2 实验方法
            1.2.2.3 实验结果
        1.2.3 抗菌肽C-BF对大鼠肠道通透性的影响
            1.2.3.1 实验材料及仪器
            1.2.3.2 实验方法
            1.2.3.3 实验结果
        1.2.4 抗菌肽C-BF对大鼠空肠紧密连接蛋白相关基因的影响
            1.2.4.1 实验材料
            1.2.4.2 实验方法
            1.2.4.3 实验结果
        1.2.5 讨论
第五章 抗菌肽对肠道屏障功能的初步机制研究
    1.1 抗菌肽C-BF与pBD2对DSS诱导的Caco-2细胞屏障功能的影响
        1.1.1 抗菌肽对Caco-2细胞单层通透性的影响研究
            1.1.1.1 实验材料及仪器
            1.1.1.2 实验方法
            1.1.1.3 实验结果
        1.1.2 抗菌肽C-BF与pBD2对Caco-2细胞单层的紧密连接蛋白的影响研究
            1.1.2.1 实验材料及仪器
            1.1.2.2 实验方法
            1.1.2.3 实验结果
        1.1.3 抗菌肽C-BF与pBD2对Caco-2细胞间紧密连接结构及肠细胞微绒毛的影响研究
            1.1.3.1 实验材料及仪器
            1.1.3.2 实验方法
            1.1.3.3 实验结果
        1.1.4 讨论
    1.2 抗菌肽C-BF与pBD2保护细菌入侵肠上皮细胞的影响
        1.2.1 抗菌肽对大肠杆菌形态结构的影响
            1.2.1.1 实验材料与仪器
            1.2.1.2 实验方法
            1.2.1.3 实验结果
        1.2.2 抗菌肽对大肠杆菌形态结构的影响
            1.2.1.1 实验材料及仪器
            1.2.1.2 实验方法
            1.2.1.3 实验结果
        1.2.3 抗菌肽对大肠杆菌侵染单个细胞的形态保护研究
            1.2.3.1 实验材料及仪器
            1.2.3.2 实验方法
            1.2.3.3 实验结果
        1.2.4 讨论
    1.3 抗菌肽C-BF对IPEC-J2细胞的炎症水平的影响及机制
        1.3.1 实验材料
        1.3.2 实验方法
        1.3.3 实验结果
        1.3.4 讨论
第六章 结论、创新点与研究展望
    1 结论
    2 创新点
    3 研究展望
参考文献
作者简历及取得的科研成果

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 王艳荣;杨峰;刘静;周娅;;槐定碱与TLR4/MD-2阻断剂对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4-NF-κB-TNF-α通路的影响[J];中国中药杂志;2012年20期

本文编号：2873681