PrP单抗的研制及其在BSE的免疫组化检测和痒病的株系特征研究中的应用

发布时间：2017-04-06 00:12

  本文关键词：PrP单抗的研制及其在BSE的免疫组化检测和痒病的株系特征研究中的应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：BSE俗称疯牛病,1986年在英国首次发现,病原体是一种缺少核酸的蛋白颗粒,称为朊毒体(Prion),是神经等细胞表面一种正常蛋白PrPC的异构体PrPSc,近年来越来越多的证据支持BSE是人类nvCJD的病因,引起了全世界公众对疯牛病的恐慌。一个国家或地区的BSE风险状况、发病情况和监测系统的全面程度,已成为牛和牛产品进出口贸易中一项重要指标,其中监测系统的有效性,关键取决于检测手段的可靠性,而免疫组化诊断方法是BSE诊断的金标准。在本研究中,首先克隆、表达、纯化了羊、牛、人的PRNP基因,以纯化的重组PrP蛋白免疫PrPo/0小鼠,成功研制出系列PrP单抗,并对单抗的免疫学反应特性进行了详细的研究。随后,以自主研制的PrP单抗为核心试剂,成功建立了BSE免疫组化诊断方法,颁布为国家标准《牛海绵状脑病诊断技术》(GB/T19180-2003),开发的试剂盒获得了国家新兽药证书。该方法已用于我国BSE的实验室监测工作,至2006年底,共检测了全国各地14014份牛脑样品,结果全部为阴性,与国际标准单抗6H4的检测符合率为100%,为我国的“无疯牛病国际认证工作”积累了重要的试验数据。最后,以PrP单抗为分子探针,在国际上最为详尽地揭示了痒病小鼠适应毒株RML的株系特征,包括PrPSc的糖基化模式、脑部的病理学特征、PrPSc的沉积特点等。1羊、牛及人PrP基因的克隆及表达根据Gene Bank中PrP基因序列设计引物,以羊、牛及人血液中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增出PrP基因并进行序列测定。同源性分析表明：推导的氨基酸序列,羊与牛的同源性为96.2%,羊与人的同源性为93.8%,牛与人的同源性为94.3%,羊、牛及人PrP的8肽重复区均为5个。将牛的PrP 25～233aa基因、羊PrP 77～226aa基因、羊PrP91～226aa基因、人PrP 91～230aa基因克隆至原核表达载体pET32a,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,His·Bind(?) Kits纯化表达产物。SDS-PAGE电泳显示：表达产物的分子量大小与预计相符；免疫印迹试验证实：牛PrP 25～233aa基因、羊PrP 77～226aa基因、羊PrP 94～226aa基因、人PrP 94～230aa基因获得了正确表达,具有良好的抗原性。2 PrP单抗的研制及其免疫学反应特性的研究随着BSE全球蔓延趋势的加剧,我国迫切需要建立BSE免疫学检测方法,具有相关免疫学反应特性的PrP单抗是检测的核心试剂。笔者以纯化的重组PrP蛋白免疫Prpo/0小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,间接ELISA试验筛选出9株可持续分泌特异性PrP抗体的杂交瘤细胞4C11、7C11、4H10、13A4、9D11、11G8、8C10、13B11、1H2。随后,对上述PrP单抗的抗原表位及免疫学反应特性进行了系统的鉴定。以原核表达的牛/羊/人PrP、正常牛/羊的脑匀浆、BSE/羊痒病阳性的脑匀浆、BSE/羊痒病阳性的脑组织切片、痒病小鼠适应毒株RML及22L的脑匀浆为抗原,测定了9株单抗的ELISA、免疫印迹、免疫组化反应特性。结果显示：单抗4C11、1H2、8C10、13A4、13811可用于BSE/羊痒病的ELISA、免疫印迹检测；单抗4C11、8C10、13811可用于BSE/羊痒病的免疫组化检测。单抗1H2、13A4在免疫印迹及免疫组化试验中可识别痒病小鼠适应毒株RML及22L。单抗7C11在免疫印迹试验中只与羊痒病PrP27-30反应,结合其抗原表位77-93aa,证实了BSE与Scrapie的PrPSc PK消化位点存在差异；单抗4H10的抗原表位推测是羊痒病PrP27-30特异性的。3单抗介导BSE免疫组化检测方法的建立及其应用在免疫组化试验中,PrP单抗4C11可特异性识别BSE、羊痒病标准阳性脑组织样品上PrPSc核心片段,并与国际标准PrP单抗6H4具有相同的染色模式。用作核心试剂,建立了单抗介导BSE免疫组化诊断方法并标准化,现已颁布成为中华人民共和国国家标准《牛海绵状脑病诊断技术》(GB/T19180-2003),研发的BSE免疫组化诊断试剂获得国家新兽药证书。该方法应用于中国BSE的实验室持续监测工作,至2006年底,共检测了全国各地采集的14,014份牛脑样品,结果全为阴性,每批次所设立的阳性对照样品检测结果均呈阳性,与6H4检测结果的符合率为100%,为我国“无疯牛病国际认证工作”积累了重要的试验数据。4痒病小鼠适应毒株RML的株系特征研究痒病小鼠适应毒株RML感染的N2a细胞(Sc-N2a),经连续传代后仍能稳定增殖Prpres,建立了感染痒病的细胞模型。以Sc-N2a细胞裂解物为接种体,脑内接种C57BL/6J小鼠,经200±28天的潜伏期后,接种的C57BL/6J小鼠全部发病死亡,临床症状均表现为特征性的“共济失调”,而对照组,接种N2a细胞裂解物的C57BL/6J小鼠以及接种Sc-N2a细胞裂解物的PrP基因敲除小鼠均正常存活,获得了痒病感染的小鼠模型。随后,PrP单抗作为分子探针,对痒病小鼠适应毒株RML的株系特征进行了详尽的研究。Sc-N2a细胞增殖的PrPsc与发病小鼠脑组织中PrPsc的免疫印迹图谱展示了相同的糖基化模式,三种糖基化形式的PrPsc具相同迁移率(分子量大小一致),而且均是以单糖基化形式为主。发病小鼠的病理学研究结果显示：脑部的海绵状空泡主要分布于脑干、大脑、小脑、丘脑；脑、脾脏、回肠末端检测到PrPSc,脑部的PrPsc主要分布于大脑皮质、海马、丘脑,四迭体、小脑、嗅球有少量的分布。综上：1、成功克隆了羊、牛、人的PrP基因。同源性分析表明：推导的氨基酸序列,羊与牛的同源性为96.2%,羊与人的同源性为93.8%,牛与人的同源性为94.3%,羊、牛及人PrP的8肽重复区均为5个。2、获得了纯化的重组牛PrP 25～233aa、羊PrP 77～226aa、羊PrP 94～226aa、人PrP 94～230aa,具有良好的抗原性。3、研制出9株PrP单抗,并明确了其抗原表位及免疫学反应特性,为下一步BSE及羊痒病的免疫学诊断方法的研制打下了坚实的基础。拿到针对PrP 77～93aa抗原表位的单抗7C11,该表位处于BSE与羊痒病PrPsc的PK消化位点的差异部位；单抗4H10的抗原表位推测是羊痒病PrP27-30特异性的；国内外尚未见有同类单抗的报道。4、建立了单抗介导BSE免疫组化诊断方法(BSE诊断的金标准),实现了我国BSE检测技术的跨越性发展,现已颁布成为国家标准《牛海绵状脑病诊断技术》(GB/T19180-2003),用于我国BSE的实验室监测工作。研发的BSE免疫组化诊断试剂于2006年获得《国家新兽药证书》。5、成功建立了感染痒病的细胞模型及小鼠模型。以PrP单抗为特异性分子探针,在国际上最为详尽地揭示了痒病小鼠适应毒株RML的株系特征,包括PrPsc的糖基化模式、脑部的病理学特征、PrPsc的沉积特点等。
【关键词】：PrP BSE 单抗 免疫组化 免疫学反应特性 痒病小鼠适应毒株 株系特征
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要2-5
• Abstract5-12
• 符号说明12-14
• 综述一 TSEs的分子致病机理14-24
• 1 TSEs的研究进展14-16
• 2 TSEs的病原学16-21
• 2.1 “Prion”学说16-17
• 2.2 PrP的结构与功能17-18
• 2.3 PrP~C-→PrP~(Sc)的转变18-20
• 2.4 PRNP基因的多样性20-21
• 3 TSEs的感染、致病机理21-24
• 综述二 TSEs的流行病学24-32
• 1 重要的动物TSEs24-27
• 1.1 痒病24
• 1.2 牛海绵状脑病24-26
• 1.3 非典型性牛海绵状脑病26
• 1.4 鹿慢性消耗性疾病26-27
• 2 TSEs的株系27-28
• 3 风险物质28-31
• 3.1 肉骨粉(MBM)29
• 3.2 肌肉组织29-30
• 3.3 动物脂肪与明胶30
• 3.4 奶30
• 3.5 血液30
• 3.6 尿30-31
• 4 跨物种传播31-32
• 4.1 牛向其它家畜的传播31
• 4.2 鹿科动物向家畜传播31
• 4.3 家畜向人类传播31-32
• 综述三 TSEs的诊断和治疗32-42
• 1 TSEs的诊断32-37
• 1.1 死后诊断32-33
• 1.2 活体诊断33-37
• 2 TSEs的治疗37-42
• 2.1 化学复合物37
• 2.2 免疫治疗37-42
• 第一章 羊、牛及人PrP基因的克隆和原核表达42-49
• 1 材料与方法42-45
• 1.1 质粒和菌种42-43
• 1.2 酶和试剂43
• 1.3 PrP基因克隆及序列测定43-44
• 1.4 PrP基因的原核表达44
• 1.5 表达产物的纯化及抗原性鉴定44-45
• 2 结果45-48
• 2.1 羊、牛及人PrP成熟蛋白基因的同源性分析45-46
• 2.2 PrP的原核表达46-48
• 3 讨论48-49
• 第二章 PrP单抗的研制及其免疫学反应特性研究49-64
• 1 材料与方法50-53
• 1.1 PrP单抗的研制50-51
• 1.2 PrP单抗的免疫学反应特性鉴定51-53
• 2 结果53-61
• 2.0 PrP单抗的筛选53
• 2.1 单抗的抗原表位53-56
• 2.2 单抗与重组蛋白的ELISA反应特性56-57
• 2.3 单抗与重组PrP蛋白的免疫印迹反应特性57-58
• 2.4 单抗与脑匀浆中PrP~C的免疫印迹反应特性58-59
• 2.5 单抗与PrP~(Sc)的免疫学反应特性59-61
• 3 讨论61-64
• 第三章 单抗介导BSE免疫组化检测方法的建立及其应用64-76
• 1 材料与方法65-69
• 1.1 试剂65
• 1.2 标准样品65
• 1.3 单抗介导BSE免疫组织化学检测方法的操作规程65
• 1.4 中国BSE的持续监测65-67
• 1.5 疯牛病免疫组织化学诊断试剂盒的制备67-69
• 2 结果69-74
• 2.1 单抗4C11介导BSE免疫组化检测方法69-74
• 2.2 中国BSE的持续监测74
• 2.3 BSE免疫组化诊断试剂盒74
• 3 讨论74-76
• 第四章 痒病小鼠适应毒株RML的株系特征研究76-91
• 1 材料与方法77-78
• 1.1 细胞培养77
• 1.2 实验动物77
• 1.3 接种体77
• 1.4 动物接种77
• 1.5 组织样品的采集77
• 1.6 病理学检查77-78
• 1.7 抗体78
• 1.8 免疫印迹78
• 2 结果78-89
• 2.1 Sc-N2a细胞增殖PrP~(res)的鉴定78-80
• 2.2 小鼠发病情况80-81
• 2.3 小鼠脑组织PrP~(Sc)的WB鉴定81-82
• 2.4 小鼠脑组织的病理学变化82-85
• 2.5 小鼠组织的免疫组化染色结果85-89
• 3 讨论89-91
• 全文总结91-92
• 参考文献92-109
• 致谢109-110
• 攻读学位期间发表论文110-111

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