农药特异性基因工程抗体的分子设计、表达及识别机制

发布时间：2020-11-20 01:10

　　 为研制农药特异性基因工程抗体,本研究以有机磷杀虫剂三唑磷和对硫磷为目标分析物,采用一种新型水溶性免疫佐剂(快速佐剂)进行了三唑磷和对硫磷单克隆抗体(单抗)的制备。该免疫佐剂操作简便,无需乳化,与人工抗原混合后可直接对Balb/c小鼠进行小腿肌肉注射,免疫脾细胞制备方便,细胞融合后筛选得到有效细胞株的阳性率超过30%;间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)筛选获得能够稳定分泌高亲合力、高特异性抗体的杂交瘤细胞株,快速制备了针对农药三唑磷和对硫磷的高亲合力单抗,灵敏度和特异性等方面与以往采用弗氏佐剂获得的单抗相当,对三唑磷的识别灵敏度(IC50)0.91 ng/mL,对对硫磷识别灵敏度(IC50)8.18ng/mL。以制备的杂交瘤细胞株为RNA来源,采用抗体亚型特异性的简并性引物,通过RT-PCR法扩增了抗对硫磷单抗的y1亚型重链可变区(VH)和κ亚型轻链可变区(VL)的基因序列,以及抗三唑磷单抗的γ1亚型VH和稀有的λ亚型VL基因序列,通过重叠延伸PCR法成功将相应的VH、VL核苷酸序列经连接肽(Gly4Ser)3串联,构建了 VH-VL连接方式的单链抗体(scFv)全长序列。将抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv的全长序列依次构建到大肠杆菌原核表达体系、杆状病毒-昆虫细胞表迗系统、毕赤酵母真核表达系统中进行可溶性表达,免疫印迹法鉴定蛋白表达,ic-ELISA法评价抗体活性。结果表明,抗三唑磷抗体和抗对硫磷抗体的VH和VL基因序列被成功扩增,在毕赤酵母表达体系中更经济有效地获得了高活性的抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv,抗体活性与亲本单抗相当,为进一步展开新型抗体的分子设计奠定了研究基础。在明确表达体系的基础上,研究了轻重链可变区取向(VH-VL、VL-VH)对抗三唑磷scFv、抗对硫磷scFv的生物活性和表达水平的影响。结果表明,轻重链可变区不同取向对抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv的亲合力和特异性没有明显影响,产物具备特异性识别相应靶标化合物的能力,对三唑磷的IC50在0.4～0.5 ng/mL,对对硫磷IC50在8.5～10.5ng/mL,抗体活性与亲本单抗相当;相较而言,抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv在VL-VH取向下,更容易获得较高水平的蛋白表迗,表达量均迗700mg/L左右。随后,尝试了两个抗三唑磷scFv的串联,设计了不同轻重链可变区取向和连接肽长度的抗三唑磷双价串联单链抗体,ic-ELISA法鉴定不同抗体的活性。结果表明,抗三唑磷双价串联单链抗体的抗体活性与连接肽长短[Gly4Ser、(Gly4Ser)3]、单价scFv的表达情况无关,与轻重链取向有关,轻链在N端的构建方式更易获得高识别能力的抗体蛋白,亲合力(IC50在0.8～0.9 ng/mL)和特异性与亲本单抗相当。在上述研究基础上,设计了不同连接方式的三唑磷-对硫磷双特异性串联单链抗体。ic-ELISA法鉴定结果表明,轻重链可变区取向同样是影响三唑磷及对硫磷双特异性串联单链抗体识别能力的重要因素。其中,以VLT-VHT-Gly4Ser-VLP-VHP的构建方式更容易获得高识别能力的抗体,但对三唑磷和对硫磷的灵敏度均下降了近7倍,同时交叉识别谱发生了改变。综上所述,在构建高亲合力单链抗体、双价串联单链抗体以及双特异性串联单链抗体时,应优先考虑轻链可变区在N端的构建方式;在设计双特异性串联单链抗体时,还需要考虑两个scFv可变区片段之间的相互干扰导致抗体活性下降和非特异性结合的问题。最后,利用Accelrys公司的Discovery studioTM,根据抗体的氨基酸序列进行同源模建,构建了抗三唑磷单链抗体和抗对硫磷单链抗体的三维模型。对抗体与农药小分子间的对接构象进行了模拟,确定了对接过程中抗体的主要氨基酸作用位点。同时,结合表面等离子共振技术(SPR)测定抗体与小分子互作反应,明确了抗体与靶分子间结合的动力学和亲合能力,为进一步提高抗体的亲合力以及稳定性奠定了坚实的基础。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：TQ450.1;Q78
【部分图文】：

抗体的制备难度远远大于大分子材料。??目前，半抗原特异性单克隆抗体的来源主要有鼠源和兔源［３４－３６］。其中，报??道最多的是通过免疫小鼠制备单克隆抗体，其流程如图１－２所示。抗原免疫动??物的过程是制备单克隆抗体的第一步，也是直接关系到能否获得所需要的具有??一定特异性的单克隆抗体的重要开端［３７１。半抗原的结构对免疫应答反应的具有??一定影响，但免疫佐剂在该过程中同时发挥了不可忽视的重要作用，尤其是??弱免疫原性的抗原，免疫佐剂是促进其产生性能良好的单克隆抗体的关键因素??之一。理想化的免疫佐剂，应对不同免疫原性的抗原均产生辅助增强作用，??即便是对弱免疫原性的抗原亦应如此，在辅助产生具备良好性能抗体的同时，??也需考虑动物福利，减少炎症或疼痛等不适感产生。据报道，在小分子化合物??单克隆抗体上应用的免疫佐剂主要有弗氏佐剂和ＧＥＲＢＵＰ７］，ＴｉｔｅｒＭａｘ佐剂??单礎醜基脂质Ａ佐剂Ｗ

ｖａｒｉｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＶＨ）和轻链的?Ｖ?区（ｌｉｇｈｔ?ｃｈａｉｎ?ｖａｒｉｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＶＬ）共同形成了??与抗原结合的区域，较错区则保证了抗体分子在和结合抗原时较大的弹性。如??图１－３?Ｂ，根据氨基酸变异程度，Ｖ区可再划分为３个超变区或互补决定区??（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｈｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，?ＣＤＲ），此区域是抗体结合特异性抗原的??部位，化是独特型决定簇的位点；而分隔开的４个区域被称为框架区??（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＦＲ），组成了可变区稳定的立体结构［６８］，而抗体可变区氨??基酸的多样性使得获得具有不同结合抗原特异性的抗体成为了可能。同时，随??着抗体基因结构的解析和阐明，基因工程技术开始应用于抗体的分子设计和改??造，多种构建模式和表这体系被应用于重组抗体的制备，使得天然抗体的一些??７??

ｆｒａｇｍｅｎｔ?（ｓｃＦｖ）?ａｎｄ?ｄｓＦｖ??单域（单区）抗体（ｓｉｎｇｌｅ?ｄｏｍａｉｎ?ａｎ化ｏｄｙ，?ｓｄＡｂ），又称纳米抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）??或重链抗体，是从骆驼科动物和１鱼的血清中分离出的一种抗体，如图１－５所??示，其体积约为传统抗体的１／１２，并且这些重链抗体的亲合为与传统抗体分子??相当，因此同样具有很强的抗原结合能为。另外很早就已有报道，传统抗体分??子中抗原与抗体的结合并非需要整个抗体分子各部分的参与，在一些情况下，??仅仅需要一条重链或是轻链即可，通常更倾向于认为单独的ＶＨ可レ乂保留相当??程度的抗原结合能为，其作用一般比ＶＬ大。因此，单域（单区）抗体亦指这??些单独存在即能具有相当的抗原结合能为的ＶＨ或ＶＬ单功能结构域分子，分??子量小、免疫原型低、不需ＶＨ和ＶＬ的栖互作用，具有相当的抗原亲合性能，??正逐级成为一个研究的热点方向
【参考文献】

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本文编号：2890710