一种转基因家蚕后部丝腺突变体表型与机制分析

发布时间：2020-11-22 02:35

　　 家蚕最具特色和被人类广泛利用的价值是高效生产丝蛋白质纤维。丝腺是家蚕高度特化的专一合成和分泌丝蛋白的器官,是人类驯化和选择家蚕的主要对象。提高丝腺的蛋白质合成与分泌效率,改良丝腺合成的蛋白质纤维成分是养蚕业世界瞩目的重大课题。伴随家蚕转基因技术的日趋成熟,有效利用丝腺超强的蛋白质合成能力生产外源蛋白,成为生物反应器研究领域热门课题；家蚕作为中国特色的模式动物研究,在农业昆虫的模式应用和生物医学的无脊椎动物替代领域也备受业者关注。本文研究了一种转基因家蚕后部丝腺突变表型与机制,主要结果如下：1.通过转基因技术构建了家蚕后部丝腺发育突变体TBH本文设计了全长3057 bp的Fib-H相似编码序列Hpl (Fib-H-like gene),通过Piggybac转座子将Hpl转入到家蚕基因组,筛选获得了后部丝腺(PSG)特异表达Hpl的突变体TBH(hpl/hpl)。经mRNA及蛋白水平检测,外源基因Hpl在PSG成功表达。TBH幼虫期的前部丝腺(ASG)与中部丝腺(MSG)发育正常,而PSG长度显著短于野生型,PSG直径变粗且透光性降低、折叠数减少、出现大量结节“念珠”状卷曲,且细胞核排列由野生型的树突分支状变得杂乱无章。TBH成熟幼虫吐丝量减少,化蛹过程中裸蛹及半化蛹个体比例显著增高。2.降低内源丝素基因的表达能够提高外源重组蛋白在后部丝腺中的表达量TBH个体中,内源的Fib-L和P25基因的转录水平与蛋白质合成及分泌水平没有下降,而Fib-H的：mRNA水平降低了71.1%；分泌的丝素蛋白中,Fib-H的比例从野生型的91.86%降至71.01%。外源重组基因Hpl的mRNA水平虽然分别只有Fib-H和Fib-L的0.73‰和0.74‰,而HPL蛋白占丝素蛋白和分泌蛋白总量的量高达18.85%和15.46%,非常高效地翻译和分泌了外源大分子蛋白HPL。进一步对PSG细胞DEGs分析,检测到891个DEGs。TBH的PSG细胞中,不仅与内质网蛋白加工相关的239个基因表达出现显著差异,应激和细胞凋亡以及神经反应相关的37个基因也受到显著影响。显示TBH系统在Fib-H转录被下调的同时,非常显著地提高了外源重组蛋白的产量。该结果对其他重组蛋白在丝腺中的生产提供了重要的参考意义及优化思路。3.后部丝腺发育异常影响其退化过程中的程序性细胞死亡进程及30K蛋白的正常表达在幼虫-蛹变态过程的丝腺退化期,通过对转基因突变体TBH的丝腺HE染色和PCD相关检测表明：TBH的丝腺在退化过程中显著慢于野生型。PSD中30K蛋白水平检测结果显示,5龄幼虫期TBH与野生型家蚕之间无明显差异；但丝腺退化过程中,野生型家蚕在丝蛋白质合成减速后,提高了30K蛋白水平合成水平,TBH家蚕的丝腺中30K蛋白基因的转录水平和30K蛋白水平明显低于野生型。推测阻遏Fib-H等丝蛋白正常表达,会导致(后部)丝腺发育畸形,并进一步改变了丝腺退化过程中的PCD与丝腺生理蛋白质合成功能的转变,影响30K等蛋白参与的生殖发育等一系列生理功能,如导致产卵量明显下降。4.以TBH为材料初步建立高蛋白/氨基酸血症模型如同高血脂、高血糖对人类身体的影响,高蛋白或氨基酸血症对人体的生命健康同样具有严重的威胁,但至今还未有高蛋白/氨基酸血症动物疾病模型的报道。本文的转基因突变体TBH个体在蛹期血淋巴中的蛋白质及游离氨基酸浓度急剧上升,出现6d-7d的高循环血高蛋白/氨基酸环境,并诱导TBH家蚕个体死亡。这是一例窗口期长占生命周期10%以上的高蛋白/氨基酸血症模型,提高对研究高蛋白/氨基酸血症动物组织病变机制、开发相关治疗药物具有重要意义。而且该时期动物(家蚕)不进食与活动,是一个封闭的生物系统,能够显著提高相关研究的准确性。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S881.2
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1 家蚕丝腺的发育与退化
        1.1 丝腺的发生与发育
        1.2 丝腺细胞的自噬与凋亡
        1.3 丝腺程序性死亡与30K蛋白合成
        1.4 丝腺程序性死亡的研究价值
    2 家蚕丝蛋白基因表达调控及表达缺陷丝腺退化模型
        2.1 丝胶蛋白的组成及其基因表达调控
        2.2 丝素蛋白的组成及其基因表达调控
        2.3 Nd裸蛹系统丝蛋白基因表达缺陷丝腺退化模型
        2.4 裸蛹系统的开发利用
    3 家蚕丝腺生物反应器研究现状及优化思路
        3.1 丝腺生物反应器的优势
        3.2 丝腺反应器的研究现状
        3.3 丝腺生物反应器的优化方向
    4 高蛋白/氨基酸血症动物模型
        4.1 人类低/高蛋白血症及其相关模型
        4.2 家蚕在生物医药及疾病模型研究中的地位
    5 立题依据与研究内容
    6 研究技术路线
第二章 家蚕后部丝腺转基因突变系统的构建及其表型分析
    1 试验动物
    2 试验试剂
        2.1 主要试剂
        2.2 主要试剂的配制
        2.3 仪器设备
    3 试验方法
        3.1 转基因载体的构建
        3.2 胚胎的显微注射及转基因个体筛选
        3.3 石蜡切片的制备
        3.4 HE染色
        3.5 DAPI染色
        3.6 酚/氯仿法基因组DNA抽提
        3.7 反向PCR
        3.8 DNA琼脂糖凝胶电泳
        3.9 DNA回收、纯化、测序及分析
        3.10 后部丝腺总RNA提取
        3.11 总RNA的消化
        3.12 RNA反转录及SqRT-PCR反应
        3.13 蛋白质的提取
        3.14 BCA法测定蛋白浓度
        3.15 Western Blot
    4 试验结果
        4.1 外源基因Hpl的设计及转基因突变系统TBH（Hpl/Hpl）的建立
        4.2 突变系统TBH家蚕Hpl基因表达鉴定
        4.3 TBH家蚕丝腺发育异常的表型分析
    5 讨论与小结
第三章 降低家蚕内源丝蛋白表达对外源重组蛋白表达的影响
    1 试验动物
    2 试验试剂
    3 试验方法
        3.1 总RNA的提取及消化
        3.2 RNA反转录及SqRT-PCR反应
        3.3 实时定量PCR
        3.4 转录组学测序（RNA-Seq）
        3.5 茧丝蛋白的提取
        3.6 BCA法测定蛋白浓度
        3.7 SDS-PAGE
        3.8 蛋白质染色
        3.9 Westem Blot
        3.10 茧丝物理性能测定
    4 试验结果
        4.1 外源重组蛋白HPL表达效率
        4.2 TBH与野生型后部丝腺的转录组差异表达基因比较
        4.3 TBH茧丝的物理性能
    5 讨论与小结
第四章 突变体TBH家蚕丝腺程序性细胞死亡过程中30K蛋白的表达
    1 试验动物
    2 试验试剂
    3 试验方法
        3.1 石蜡切片的制作
        3.2 HE染色及DAPI染色
        3.3 活性氧检测
        3.4 蛋白提取及浓度的测定
        3.5 Western Blot
        3.6 免疫组化
        3.7 DNA Ladder
        3.8 RNA的提取、消化、转录、半定量与定量PCR及电泳
    4 试验结果
        4.1 TBH家蚕变态发育过程中丝腺退化延迟
        4.2 TBH家蚕后部丝腺退化过程中自噬与凋亡相关基因表达
        4.3 TBH家蚕后部丝腺退化过程中相关蛋白质的修饰变化
        4.4 TBH家蚕后部丝腺退化过程中30K蛋白表达分析
        4.5 TBH丝腺退化过程中的活性氧水平分析
    5 讨论与小结
第五章 高蛋白/高氨基酸血症家蚕动物模型
    1 试验动物
    2 试验试剂
    3 试验方法
        3.1 死亡率统计方法
        3.2 血清蛋白的提取及测定方法
        3.3 血清总游离氨基酸样品的提取方法
        3.4 氨基酸的测定方法
        3.5 Western Blot
    4 试验结果
        4.1 TBH家蚕幼虫吐丝及蛹期血淋巴蛋白浓度
        4.2 TBH家蚕幼虫吐丝及蛹期血淋巴游离氨基酸含量
        4.3 TBH家蚕幼虫吐丝及蛹期死亡率
        4.4 高血/高氨基酸血症对TBH个体的生殖影响
    5 讨论与小结
第六章 结论
    1 论文研究结论
    2 论文创新点
    3 后续研究展望与建议
参考文献
会议与发表论文及申请专利
资助项目
攻读学位期间参与项目
文中主要缩略词表
致谢


本文编号：2893970