mTOR信号通路在LPS诱导肉鸡肠道黏膜免疫应激中的作用

发布时间：2017-04-08 16:45

  本文关键词：mTOR信号通路在LPS诱导肉鸡肠道黏膜免疫应激中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肠道黏膜免疫系统在机体的免疫应答中发挥着重要作用,本研究即以LPS激发炎症反应为基础建立活体和离体培养的肠道组织的免疫应激模型,探讨mTOR/p70S6K参与LPS激活的免疫应答机制,并从日粮营养素的角度进一步分析营养对免疫机能的调控,初步探讨mTOR/p70S6K参与营养素调控的机制。1.RAPA处理对肉鸡肠道黏膜发育的影响应用mTOR的特异性抑制剂-雷帕霉素(RAPA)研究对肠道黏膜发育的影响。4d时,选取体重相近的90只肉鸡,分别腹腔注射0.4 mg/kg BW(低剂量)、1.0 mg/kg BW(高剂量)和RAPA溶解介质(对照),每天定点注射一次,连续注射6d。试验结果显示,RAPA能显著的影响体重和肠道绒毛发育,导致体重明显下降(P0.05),绒毛萎缩、变短(P0.05),死亡率升高(P0.05);并能显著地降低肠道紧密连接蛋白Claudin1的蛋白表达(P0.05)。同时,免疫组化和Western Blot显示肠道IgA表达显著降低(P0.05),这表明mTOR参与肠道黏膜的发育和IgA蛋白的合成,在体内肠道黏膜稳态中发挥着重要作用。2.口服LPS诱导的免疫应激对肠道黏膜免疫的影响机制试验对4d的AA肉鸡分别给予0.25mg/kg BW和0.50 mg/kg BW的LPS口服处理,研究在LPS处理后4h-24h不同时间点对肠道黏膜免疫机制的影响。检测洗液中SIgA的浓度结果发现,不同浓度的LPS口服对十二指肠和空肠没有显著的影响,在回肠中表现出有差异,尤其是500μg/kg BW的LPS处理后在回肠中呈现出时间依赖性的规律性增加;同时,LPS处理后4h-6h的NF-κBp65和p38 MAPK蛋白表达显著升高(P0.05),随着时间延长差异渐小,至18h,21h时两者的蛋白表达显著降低(P0.05)。结果表明,口服LPS处理可以引起肠道黏膜的免疫应激,并能影响肠道表现在时间和空间的特异性。3.体外肠道组织的培养及其建立的LPS免疫应激模型试验应用19胚龄的SPF鸡胚建立离体的肠道组织培养模型,并分别用0,0.5,1,2μg/m L的LPS给予免疫应激,观察LPS处理2h和4h后对肠道组织的影响。结果显示,SIgA的浓度在LPS处理后2h随着LPS浓度的增加表现为逐渐升高的趋势,且在2μg/m L的LPS处理后差异显著(P0.05);各种炎性细胞因子的mRNA水平和NF-κB、MAPK信号蛋白的磷酸化水平结果也显示,不同浓度的lps均显著的激活细胞因子的表达和nf-κb、mapk信号通路,尤以2μg/ml的lps处理2h的差异最显著(p0.05),表明lps可以引发体外培养的肠道组织的免疫应激,激活tlr-nf-κb、mapk-炎性细胞因子-siga信号通路。4.mtor参与调节lps诱导的炎性机制应用试验3中模型,检测可能与siga等蛋白合成相关的mtor信号通分子,结果显示,lps处理肠道组织后,其mtor/p70s6k的磷酸化水平均显著地降低(p0.05),这提示mtor信号通路可能参与lps诱导的炎症反应机制。同时,应用试验3中2μg/ml的lps处理2h建立的体外培养模型,用10mm、20mm和40mm的leu来激活被抑制的mtor信号。结果发现,40mm的leu恢复了由lps抑制的mtor/p70s6k的磷酸化水平,并抑制了由单独lps处理显著激活的炎性细胞因子、siga以及nf-κbp65、p38,jnkmapk蛋白的磷酸化水平,这表明mtor/p70s6k信号通路参与lps诱导的炎性反应,调控下游信号分子的免疫应答。5.mtor参与5-htp、va等营养素调控免疫应激的机制初探本试验探讨了日粮中添加5-htp或va对lps诱导的免疫应激炎性反应的调控作用。选取80只体重相近的肉鸡,7d开始饲喂0.2%的5-htp日粮和基础日粮,连续饲喂4w后腹腔注射1mg/kgbwlps。结果显示,基础日粮下,lps能显著地降低了mtor下游的p70s6k的磷酸化水平(p0.05),显著地激活il-6等炎性细胞因子和nf-κb、mapk信号分子的表达(p0.05);而5-htp日粮能降低炎性细胞因子的mrna水平,且有效抑制了由lps激活的nf-κb/mapk-细胞因子的信号通路,这表明5-htp缓解了lps应激诱导的炎性反应;同时5-htp日粮也恢复了由lps抑制的mtor下游的p70s6k的磷酸化水平,提高了十二指肠洗液中siga的浓度(p0.05)。同时,选取80只体重相近的肉鸡,1d开始饲喂1500iu/kg和6000iu/kg的两种梯度va日粮,连续饲喂10d后,应用对呼吸道黏膜造成免疫应激的lps(1mg/kgbw)进行喷雾2h处理。结果显示,基础日粮下,lps喷雾处理显著的激活了il-6、tnf-α等炎性因子的基因表达和p38mapk的总蛋白表达(p0.05),而日粮添加va后,lps喷雾处理后未见有炎性细胞因子的高表达和炎性通路的激活,同时肠道紧密连接蛋白的表达也相应升高(p0.05),且p70s6k的磷酸化水平较基础日粮组显著升高(p0.05),这体现了va日粮对机体的保护作用,免受外界应激的刺激损伤,增强机体免疫力。本试验提示mTOR/p70S6K信号通路可能参与营养素调控免疫应激对肠道黏膜免疫的机制中。综上所述,mTOR信号分子参与肉鸡肠道黏膜的发育和SIgA蛋白的合成,同时应用离体培养的肠道组织模型证实mTOR/p70S6K在LPS诱导的炎症反应机制中发挥负调控作用。同时发现5-HTP和VA等营养素能缓解不同方式的LPS应激对肠道造成的炎性反应,也提示mTOR/p70S6K参与到营养素调控肠道黏膜免疫机制中。这对家禽相关应激的预防及营养素添加的调节机制研究有着十分重要的意义。
【关键词】：肠道黏膜免疫 离体肠道组织培养 炎性反应 营养素 LPS mTOR/p70S6K SIgA
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 符号说明5-12
• 中文摘要12-15
• Abstract15-19
• 1 前言19-38
• 1.1 家禽黏膜免疫系统19-23
• 1.1.1 家禽黏膜免疫系统的结构19-20
• 1.1.2 家禽黏膜免疫系统的功能20-21
• 1.1.2.1 特异性免疫功能20
• 1.1.2.2 非特异性免疫功能20
• 1.1.2.3 免疫耐受20-21
• 1.1.3 肠道黏膜免疫系统的特点21-22
• 1.1.4 家禽黏膜免疫的调节22-23
• 1.1.4.1 黏膜上皮细胞的调节作用22-23
• 1.1.4.2 T细胞和B细胞的调节作用23
• 1.2 黏膜免疫主要效应因子SIgA23-24
• 1.2.1 SIgA的结构23-24
• 1.2.2 SIgA在黏膜免疫应答中的作用24
• 1.3 免疫应激24-26
• 1.3.1 应激概述24-25
• 1.3.2 免疫应激25-26
• 1.3.3 免疫应激对家禽的影响26
• 1.4 LPS诱导的免疫应激26-32
• 1.4.1 LPS的特性26-27
• 1.4.2 LPS建立模型27-28
• 1.4.3 LPS免疫应激介导的炎症细胞因子的释放28-29
• 1.4.4 LPS免疫应激的作用机制（NF-κB信号通路）29-30
• 1.4.5 LPS免疫应激的作用机制（MAPKs信号通路）30-32
• 1.5 mTOR信号通路32-35
• 1.5.1 mTOR概述32-33
• 1.5.2 mTOR作用33
• 1.5.3 mTOR与炎性反应33-34
• 1.5.4 Leu对mTOR的调控作用34-35
• 1.6 营养与肠道黏膜免疫35-37
• 1.6.1 维生素A（VA）35-36
• 1.6.2 5-羟色氨酸（5-HTP）36-37
• 1.7 选题目的及意义37-38
• 2 材料与方法38-54
• 2.1 试验动物管理38
• 2.2 试验鸡胚38
• 2.3 试验试剂与主要仪器38-42
• 2.4 试验设计42-47
• 2.4.1 RAPA处理对肠道黏膜发育和免疫的影响42
• 2.4.1.1 试验处理42
• 2.4.1.2 样品采集42
• 2.4.1.3 测定指标42
• 2.4.2.服LPS对肠道组织的影响42-43
• 2.4.2.1 试验处理42-43
• 2.4.2.2 采集样品43
• 2.4.2.3 指标测定43
• 2.4.3 原代肠道上皮细胞的培养43
• 2.4.4 体外肠道组织的培养及体外LPS免疫应激模型的建立43-44
• 2.4.4.1 试验处理43
• 2.4.4.2 采集样品43
• 2.4.4.3 指标检测43-44
• 2.4.5 mTOR参与LPS诱导的信号通路44
• 2.4.5.1 试验处理44
• 2.4.5.2 样品采集44
• 2.4.5.3 指标检测44
• 2.4.6 mTOR参与营养素调控LPS免疫应激的初探44-47
• 2.4.6.1 试验处理44-46
• 2.4.6.2 样品采集46
• 2.4.6.3 指标检测46-47
• 2.5 试验方法47-53
• 2.5.1 肠道原代上皮细胞的培养47
• 2.5.2 小肠绒毛高度和隐窝深度的测定47-48
• 2.5.3 免疫组化定位IgA的阳性信号48
• 2.5.4 酶联免疫吸附（ELISA）检测SIgA效价48-49
• 2.5.5 相关基因mRNA水平检测49-52
• 2.5.5.1 组织中提取总RNA49
• 2.5.5.2 RNA浓度的测定49-50
• 2.5.5.3 反转录50
• 2.5.5.4 荧光定量PCR50-52
• 2.5.6 蛋白提取和Western Blotting52-53
• 2.5.6.1 组织蛋白的提取52
• 2.5.6.2 组织蛋白浓度的测定52
• 2.5.6.3 蛋白变性52
• 2.5.6.4 Western Blotting52-53
• 2.6 数据处理53-54
• 3 结果与分析54-76
• 3.1 RAPA处理对肠道黏膜发育和免疫的影响54-59
• 3.1.1 体重变化54
• 3.1.2 形态学观察54-56
• 3.1.3 免疫组化定位空肠IgA的阳性信号56-57
• 3.1.4 mTOR，IgA，Claudin1和Occludin的相对表达量57-59
• 3.2.服LPS对肠道黏膜免疫应激的影响机制59-62
• 3.2.1.服不同浓度LPS对肠道黏膜中SIgA分泌的影响59-60
• 3.2.2 参与调控LPS免疫应激的信号通路60-62
• 3.2.2.1 不同时间点IgA和TLR4的mRNA表达水平60-61
• 3.2.2.2 不同时间点NF-κB p65和p38 MAPK蛋白的表达水平61-62
• 3.3 肠道上皮细胞的原代培养62
• 3.4 LPS应激体外培养的肠道组织模型62-66
• 3.4.1 肠道组织的体外培养62-63
• 3.4.2 LPS应激对培养液上清中SIgA浓度的影响63-64
• 3.4.3 LPS处理对相关细胞因子在不同时间点的影响64-65
• 3.4.4 LPS处理对MAPK和NF-κB信号分子的影响65-66
• 3.4.5 LPS处理对mTOR信号分子的影响66
• 3.5 mTOR参与调控LPS诱导的信号通路66-69
• 3.5.1 mTOR调节LPS诱导的SIgA合成66-67
• 3.5.2 mTOR参与调节LPS诱导的细胞因子的表达67
• 3.5.3 mTOR参与调节LPS诱导的MAPK、NF-κB信号67-69
• 3.6 mTOR参与营养素调控LPS免疫应激的初探69-76
• 3.6.1 mTOR参与 5-HTP日粮的调控机制研究69-72
• 3.6.1.1 血清和各段肠道黏膜中分泌的SIgA的浓度69-70
• 3.6.1.2 5-HTP对十二指肠中不同细胞因子的调控作用70
• 3.6.1.3 5-HTP对mTOR、MAPK和NF-κB信号蛋白的调控作用70-72
• 3.6.2 mTOR参与VA日粮的调控机制研究72-76
• 3.6.2.1 各段肠道黏膜中分泌的SIgA的浓度72
• 3.6.2.2 VA对十二指肠中不同细胞因子的调控作用72-73
• 3.6.2.3 VA对mTOR/p70S6K和MAPK、NF-κB信号蛋白的调控作用73-76
• 4 讨论76-88
• 4.1 mTOR信号对肠道黏膜发育和免疫的影响76-77
• 4.2.服LPS对肠道黏膜免疫的影响机制77-79
• 4.3 建立体外培养的肠道组织模型79-82
• 4.3.1 体外肠道组织的培养79
• 4.3.2 体外肠道组织建立的免疫应激模型79-81
• 4.3.3 LPS负调控mTOR信号通路81-82
• 4.4 mTOR参与调控LPS诱导的免疫应激82-83
• 4.4.1 Leu抑制LPS激活的SIgA82
• 4.4.2 Leu缓解LPS抑制的mTOR及其下游信号表达82-83
• 4.4.3 mTOR参与调控LPS激活的免疫应答83
• 4.5 mTOR参与营养素的调控机制初探83-88
• 4.5.1 mTOR参与 5-HTP日粮的调控机制研究84-85
• 4.5.2 mTOR参与VA日粮的调控机制研究85-88
• 5 结论88-89
• 参考文献89-103
• 致谢103-104
• 攻读博士期间待发表与已发表论文情况104

【参考文献】

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1 李晓晴;杨仙珊;赵鹏;丁美;赵军;段钟平;张晶;;人肝细胞系5-羟色胺自分泌系统的研究[J];肝脏;2010年04期

  本文关键词：mTOR信号通路在LPS诱导肉鸡肠道黏膜免疫应激中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：293271