骨保护素对破骨细胞及其前体黏附结构和融合的影响

发布时间：2017-04-08 12:14

  本文关键词：骨保护素对破骨细胞及其前体黏附结构和融合的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨内稳态失衡是动物主要的健康问题之一。破骨细胞的分化和活化,在健康动物及患病动物骨重塑中起着至关重要的作用。破骨细胞具有骨吸收活性,由单核细胞巨噬细胞／单核细胞谱系的造血前体细胞融合形成。破骨细胞通过伪足小体,一种特异性的黏附结构,附着在细胞外基质上。伪足小体可形成F-actin环,类似于进行骨吸收的破骨细胞形成的环状封闭带。骨保护素(OPG)和核因子KB受体激活剂(RANK)都是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员,通过和RANK配体(RANKL)竞争性地结合,调控破骨细胞形成和功能。RANKL通过激活RANK,促进破骨细胞分化；而OPG连接至RANKL,抑制破骨细胞形成。已有研究发现了OPG作用于破骨细胞分化、融合及黏附的一些重要细节。但这些研究主要集中在编码破骨细胞特异性标志物,潜在的融合因子和黏附相关调控因子基因的表达,通过体外阻断,或过表达方式来研究。因此,OPG抑制破骨细胞分化、融合和黏附的许多重要分子机制仍不明确。本研究以25 ng/mL M-CSF和30 ng/mL RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成的破骨细胞为研究对象,在分化过程中添加不同浓度OPG进行处理,通过形态学鉴定、实时细胞动态分析(RTCA)、免疫印迹法(Western blot)等技术手段,探索OPG对破骨细胞黏附结构和融合的影响,揭示相关调控机制,为进一步阐明OPG对破骨细胞形成及功能的抑制作用提供了理论依据。研究内容如下：1.OPG对不同分化阶段破骨细胞的形成及功能的影响为了研究OPG对不同分化阶段破骨细胞的黏附及活性的影响,本实验采用M-CSF和RANKL处理RAW264.7细胞,培养1、3、5、7 d后,各组分别添加80 ng/mL OPG作用24 h。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和免疫荧光检测破骨细胞分化和黏附能力的变化,RTCA监测细胞生长曲线变化,Western blot检测TRAP、RANK、integrin β3、 matrix metalloproteinase 9 (MMP9)、 cathepsin K、carbonic anhydrase Ⅱ(CA Ⅱ) 及 vesicular-type H+-ATPase A1 (V-ATPase A1)蛋白表达量的变化。结果显示,OPG处理显著增强分化初期细胞(1 d)的存活、增殖及黏附能力,并促进RANK和integrin (β3表达量显著增高(p0.01)。相反,和对照组相比,OPG抑制成熟的破骨细胞(3-7d)的分化及黏附结构的形成,并显著降低了TRAP、RANK、integrin β3、MMP9、cathepsin K、CA Ⅱ及V- ATPase A1标志性蛋白的表达水平(p0.01)。说明OPG对于破骨细胞分化不同阶段的生物效应是有差异的,促进破骨细胞前体的黏附和存活,抑制各阶段破骨细胞的分化,并降低分化至中末期的成熟的破骨细胞活性。2.OPG对破骨细胞黏附结构的影响及调控机理为了揭示OPG对破骨细胞黏附结构、黏附相关蛋白表达及分布的影响,本实验采用M-CSF和RANKL处理RAW264.7细胞3d后,在无血清培养条件下,加入不同浓度OPG(0、20、40、80 ng/mL)继续培养24 h,TRAP染色检测不同剂量OPG对破骨细胞分化的影响,扫描电子显微镜(SEM)、RTCA及激光共聚焦技术观察破骨细胞外周黏附结构的动态变化,Western blot检测Pyk2和Src酪氨酸磷酸化水平。结果表明,OPG能够抑制破骨细胞的分化,使细胞黏附结构收缩且呈时间和剂量依赖关系。结合激光共聚焦和Western blot结果发现,OPG导致破骨细胞Pyk2发生去磷酸化,降低了Pyk2在细胞外周黏附结构区域的表达及分布,诱导Tyr 402 Pyk2和Tyr 416 Src向细胞中央聚集,提高了其在细胞中央的表达量,但显著降低了Tyr 527 Src磷酸化水平(p0.01),增强了Pyk2和Src在破骨细胞中央区域的联系。表明,破骨细胞为了适应OPG的调控,将Src作为衔接蛋白,代偿减少的Pyk2,并与Pyk2一起从破骨细胞外周黏附区域向中心区域转移。说明,OPG通过调控破骨细胞内Pyk2和Src磷酸化及其在细胞内的分布情况,破坏破骨细胞黏附结构。3.OPG调控破骨细胞黏附结构的Ca2+、ERK和p38 MAPK信号通路为了探讨Ca2+和MAPKs信号通路在OPG调控破骨细胞黏附结构中的作用,本实验以细胞内钙离子螫合剂Bapta-AM(5μM),ERK抑制剂U0126(5 μM)和p38抑制剂SB202190(10μM)与OPG (40 ng/mL)联合作用破骨细胞。3h后,TRAP染色、SEM、RTCA、流式细胞术和Western blot分别检测破骨细胞的生成、活力、黏附结构和形态变化,细胞内游离Ca2+浓度[Ca2+]i、Pyk2和Src的磷酸化状态。结果表明,OPG抑制了破骨细胞生成和黏附结构的形成,显著降低了[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平(p0.01),并使Src-pY416磷酸化水平显著增高(p0.01)。Bapta-AM、U0126和SB202190明显抑制了OPG对破骨细胞分化和黏附结构的作用。Bapta-AM和U0126使降低的[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平恢复至对照组水平,而SB202190没有这种作用。这三种抑制剂都抑制了OPG引起的Src-pY416磷酸化水平升高。说明,OPG通过Ca2+和ERK信号通路破坏破骨细胞黏附结构,激活Src使其作为衔接蛋白补充减少的磷酸化Pyk2,而p38 MAPK信号通路可能在这过程中发挥着不同的作用。4.OPG抑制破骨细胞及其前体融合的调控机理为了揭示OPG对破骨细胞及其前体融合的分子调控机理,本研究利用OPG(40ng/mL)单独或联合ATP (100μM)作用破骨细胞48 h, TRAP染色、RTCA、Western blot和激光共聚焦分别检测破骨细胞及前体细胞的分化、融合率、融合关键因子(CD44、CD47、 DC-STAMP、 ATP6V0D2及Cx43)的表达量和定位变化。结果表明,OPG抑制了多核破骨细胞的形成,与OPG组比较,OPG与ATP联合作用,多核破骨细胞(以细胞核数目分类)数目显著增多(p0.01)。与对照组比较,OPG仅减少破骨细胞前体CD47的表达量,并使多核的破骨细胞CD44、CD47、DC-STAMP、ATP6V0D2和总Cx43的表达水平显著下降(p0.01)；与OPG组比较,OPG与ATP联合作用,这些融合相关因子的表达量显著上升(p0.01)。而OPG降低了破骨细胞及前体细胞中CD44+、CD47+、DC-STAMP+、 ATP6V0D2+、Cx43+细胞在总体的分布比例(p0.01)。表明OPG通过不同的机制分别调控多核的破骨细胞和单核的前体细胞融合,这些调控机制都可能涉及ATP信号通路。
【关键词】：骨保护素 破骨细胞 分化 黏附结构 Src Pyk2 Ca~(2+) MAPKs 融合 ATP
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-14
• 符号说明14-18
• 第一部分 文献综述18-53
• 第一章 破骨细胞融合及相关调控机理18-27
• 1 破骨细胞的融合18-19
• 2 破骨细胞融合的生物学意义19-21
• 3 调控破骨细胞融合的关键因子21-27
• 3.1 RANKL依赖性融合相关因子21-23
• 3.2 RANKL非依赖性融合相关因子23-25
• 3.3 膜结构域和因子间的相互作用25-27
• 第二章 OPG与骨骼疾病27-36
• 1 OPG/RANKL/RANK系统29-31
• 1.1 OPG及RANKL的发现29
• 1.2 OPG及RANK/RANKL的功能29-30
• 1.3 OPG/RANKL/RANK系统与骨骼疾病30-31
• 2 破骨细胞相关疾病31-34
• 2.1 骨质疏松31-32
• 2.2 关节炎32-33
• 2.3 骨髓瘤骨病33-34
• 2.4 Paget病34
• 3 OPG在临床诊断中的应用34-35
• 4 OPG在临床治疗中的应用35-36
• 5 本研究的目的意义36
• 参考文献36-53
• 第二部分 试验研究53-115
• 第一章 OPG对不同分化阶段破骨细胞的形成及功能的影响53-69
• 1 材料和方法53-57
• 1.1 实验细胞株53-54
• 1.2 主要仪器54
• 1.3 主要化学试剂54
• 1.4 细胞培养及处理54-55
• 1.5 破骨细胞TRAP染色55
• 1.6 xCelligence系统检测细胞生长曲线变化55
• 1.7 免疫荧光检测细胞黏附结构55-56
• 1.8 免疫印迹法检测破骨细胞标志性蛋白的表达56
• 1.9 数据分析56-57
• 2 结果57-63
• 2.1 OPG对不同分化阶段破骨细胞形成的影响57-60
• 2.2 OPG对不同分化阶段的破骨细胞黏附结构的影响60-62
• 2.3 OPG对不同分化阶段破骨细胞特征性蛋白表达的影响62-63
• 3 讨论63-65
• 参考文献65-69
• 第二章 OPG对破骨细胞黏附结构的影响及调控机理69-85
• 1 材料和方法69-71
• 1.1 实验细胞株69-70
• 1.2 主要仪器70
• 1.3 主要化学试剂70
• 1.4 细胞培养及处理70
• 1.5 xCelligence系统检测生长曲线变化70
• 1.6 破骨细胞TRAP染色及计数70
• 1.7 扫描电镜观察破骨细胞黏附结构70-71
• 1.8 免疫荧光及激光共聚焦观察黏附相关蛋白的分布71
• 1.9 免疫印迹法检测黏附相关蛋白的表达71
• 1.10 数据分析71
• 2 结果71-79
• 2.1 OPG对破骨细胞分化的影响71-72
• 2.2 OPG对破骨细胞黏附结构的影响72-74
• 2.3 OPG对Pyk2和Src酪氨酸磷酸化的影响74-76
• 2.4 OPG对破骨细胞Pyk2和Src分布的影响76-79
• 3 讨论79-81
• 参考文献81-85
• 第三章 OPG调控破骨细胞黏附结构的Ca2+、ERK和p38 MAPK信号通路85-101
• 1 材料和方法85-87
• 1.1 实验细胞株85-86
• 1.2 主要仪器86
• 1.3 主要化学试剂86
• 1.4 细胞培养及处理86
• 1.5 xCelligence系统检测细胞生长曲线变化86
• 1.6 破骨细胞TRAP染色及计数86
• 1.7 流式细胞术检测细胞内游离钙离子浓度[Ca~(2+)]_i86-87
• 1.8 扫描电镜观察破骨细胞形态变化87
• 1.9 免疫印迹法检测黏附相关蛋白的表达87
• 1.10 数据分析87
• 2 结果87-95
• 2.1 Ca~(2+)、Erk和p38 MAPK抑制剂对OPG调控破骨细胞分化的影响87-89
• 2.2 Ca~(2+)、Erk和p38 MAPK抑制剂对OPG调控破骨细胞黏附结构的影响89-92
• 2.3 Ca~(2+)、Erk和p38 MAPK抑制剂对OPG调控[Ca~(2+)]_i的影响92-93
• 2.4 Ca~(2+)、Erk和p38 MAPK抑制剂对OPG介导破骨细胞Pyk2和Src磷酸化的影响93-95
• 3 讨论95-97
• 参考文献97-101
• 第四章 OPG抑制破骨细胞及其前体融合的调控机理101-115
• 1 材料和方法101-103
• 1.1 实验细胞株101-102
• 1.2 主要仪器102
• 1.3 主要化学试剂102
• 1.4 细胞培养及处理102
• 1.5 xCelligence系统检测生长曲线变化102
• 1.6 破骨细胞TRAP染色及计数102
• 1.7 免疫荧光及激光共聚焦检测融合相关因子的分布102-103
• 1.8 免疫印迹法检测融合相关因子的表达103
• 1.9 数据分析103
• 2 结果103-110
• 2.1 OPG对破骨细胞分化融合的影响103-105
• 2.2 OPG对破骨细胞及其前体融合相关蛋白表达的影响105-106
• 2.3 OPG对融合相关因子在细胞中分布的影响106-109
• 2.4 ATP对OPG调控破骨细胞及其前体融合相关因子表达的影响109-110
• 3 讨论110-112
• 参考文献112-115
• 全文结论115-116
• 致谢116-117
• 攻读博士学位期间发表论文117-118

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本文编号：292843