禾谷镰刀菌中TOR信号途径与MAPK信号途径互作机制研究

发布时间：2017-04-12 03:13

  本文关键词：禾谷镰刀菌中TOR信号途径与MAPK信号途径互作机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：真核生物中雷帕霉素作用靶标(Target of Rapamycin, TOR)信号途径在感受胞外环境中的营养与胁迫、调控细胞生长中发挥重要作用。我们前期对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)TOR信号途径研究发现,TOR信号途径不仅调控禾谷镰刀菌的致病与毒素合成、还与细胞壁完整性(CWI)途径互作共同调控病菌对细胞壁胁迫因子的反应。本文在此基础上深入研究禾谷镰刀菌中TOR信号途径与高渗透性甘油(HOG)信号途径的相互作用机制,并系统研究了Gpmk1信号途径关键元件的生物学功能,解析TOR信号途径与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径的互作,主要研究结果如下：1、禾谷镰刀菌中TOR信号途径上蛋白激酶FgSch9调控病菌气生菌丝的生长、菌丝分枝和孢子萌发。FgSCH9敲除突变体对渗透胁迫、氧化胁迫、细胞壁胁迫因子以及雷帕霉素的敏感性显著升高,对高温胁迫表现抗性。鉴定到FgSch9的互作蛋白FgMaf1,发现FgMaf1与FgSch9共同调控禾谷镰刀菌的致病以及DON毒素的合成。免疫亲和捕获和免疫共沉淀实验发现FgSch9可以同时与FgTor及FgHog1互作,FgSCH9敲除突变体与FgHOG1敲除突变体对外界的渗透胁迫与氧化胁迫的敏感性均显著增加,而且双敲突变体对外界胁迫的敏感性高于单敲突变体,表明TOR与HOG信号途径互作共同调控病菌对渗透和氧化等外界胁迫反应。2、禾谷镰刀菌TOR信号途径上Rag-GTPase FgGtr1与FgGtr2以复合体形式调控了病菌气生菌丝的生长、产孢、孢子萌发、致病以及DON毒素的合成。免疫亲和捕获和免疫共沉淀实验发现复合体FgGtr1-FgGtr2可以与TOR下游的关键元件FgTap42互作；有趣的是,FgGtr1-FgGtr2复合体可以与FgHog1互作,FgGTR1与FgGTR2基因的缺失导致病菌对适乐时(激活HOG信号途径的杀菌剂)的抗性增强。该研究结果进一步证明TOR与HOG信号途径存在相互作用。3、在模式酵母中,Shol是HOG途径上游响应外界渗透胁迫的受体蛋白。我们研究发现,禾谷镰刀菌中Shol的同系物(FgShol)在病菌对渗透胁迫的抗逆反应并不发挥重要作用,但FgShol参与调控病菌的菌丝生长、产孢、致病以及DON毒素合成,此夕,△FgShol对细胞壁胁迫物质的敏感性显著增加。Western blotting试验发现,FgShol可以正向调控细胞壁完整性(CWI)信号途径中关键激酶FgMgvl的磷酸化水平。酵母双杂、免疫共沉淀与荧光共定位实验发现,FgShol可以与MAPK激酶复合体FgSte50-FgStell-FgSte7互作；与FgShol类似,FgSte50-FgStell-FgSte7复合体也参与调控病菌的菌丝生长、产孢、致病以及DON毒素合成,该复合体每个组分的突变体在麦穗上完全丧失致病力；Western blotting试验验发现,FgShol与4APK激酶复合体FgSte50-FgStell-FgSte7可以正向调控FgGpmkl的磷酸化水平。该研究结果表明,禾谷镰刀菌中FgShol是FgGpmkl和CWI信号途径上游的一个受体蛋白。4、鉴定到FgGpmkl下游一个转录调控因子FgSte12,发现FgSte12并不参与调控禾谷镰刀菌的菌丝生长、分生孢子的形成以及DON毒素合成,但AFgSte12完全丧失致病性,并且胞外蛋白酶与纤维素酶的分泌显著减少,表明FgGpmk1信号途径通过FgSte12调控病菌的致病性。本研究结果表明,禾谷镰刀菌中TOR信号途径与多个MAPK信号途径互作共同调控病菌生长、致病、毒素合成等多个重要的生命活动。研究结果为发掘TOR途径上的新药靶提供重要依据。
【关键词】：小麦赤霉病 禾谷镰刀菌 TOR信号途径 HOG信号途径 Gpmk1信号途径 致病性 DON毒素
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.121.45
【目录】：

• 致谢6-8
• 全文摘要8-10
• Abstract10-14
• 第一章 文献综述14-43
• 1 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)研究概况14-27
• 1.1 小麦赤霉病概述14-15
• 1.2 禾谷镰刀菌的生物学特征15-18
• 1.3 小麦赤霉病的防控18-22
• 1.4 禾谷镰刀菌侵染机制研究进展22-27
• 2 TOR(Target of Rapamycin)信号途径研究概况27-37
• 2.1 真核生物中TOR蛋白复合体的结构与功能27-32
• 2.2 真核生物中TORC1所介导的信号途径概述32-36
• 2.3 病原真菌中TOR途径的研究进展36-37
• 3 病原真菌中MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信号途径的研究进展37-42
• 3.1 病原真菌中HOG途径的研究进展40
• 3.2 病原真菌中Fus3/Kssl途径的研究进展40-41
• 3.3 病原真菌中CWI途径的研究进展41-42
• 4. 本研究目的与内容42-43
• 第二章 材料与方法43-63
• 1 实验材料43-44
• 1.1 菌株43
• 1.2 Western实验所用抗体43
• 1.3 构建载体所用质粒43-44
• 1.4 用于致病性实验所用植物材料44
• 2 实验方法44-63
• 2.1 禾谷镰刀菌的培养、保存、以及产孢方法44
• 2.2 PCR技术44
• 2.3 PCR产物纯化44-45
• 2.4 禾谷镰刀菌基因组DNA的提取45-46
• 2.5 DNA电泳方法46
• 2.6 DNA克隆技术与载体构建46-48
• 2.7 禾谷镰刀菌基因敲除、回补载体的构建以及转化子的鉴定48-49
• 2.8 禾谷镰刀菌的原生质转化方法49
• 2.9 禾谷镰刀菌转化子的Southern blot分析49-52
• 2.10 禾谷镰刀菌RNA的提取以及基因表达水平分析52-54
• 2.11 产孢量分析、子囊壳产生和菌丝孢子的染色54
• 2.12 禾谷镰刀菌对细胞胁迫压力、杀菌剂敏感性的测定54-56
• 2.13 禾谷镰刀菌致病性实验56
• 2.14 禾谷镰刀菌菌丝孢子的显微镜镜观察56
• 2.15 禾谷镰刀菌侵染小麦后麦粒中DON毒素含量测定56-57
• 2.16 酵母双杂交分析57-58
• 2.17 FLAG和GFP标签融合蛋白载体构建58-59
• 2.18 Western blot方法59-61
• 2.19 蛋白质免疫共沉淀61
• 2.20 亲和捕捉实验61-63
• 第三章 结果与分析63-142
• 1. 禾谷镰孢菌中TOR信号途径与HOG信号途径之间的相互作用63-101
• 1.1 禾谷镰刀菌中蛋白激酶FgSch9介导了TOR信号途径与HOG信号途径的互作63-87
• 1.2 禾谷镰刀菌中Rag-GTPases介导了TOR信号途径与HOG信号途径之间的互作87-98
• 1.3 小结与讨论98-101
• 2. 禾谷镰刀菌中Gpmk1信号途径关键元件的功能分析101-142
• 2.1 禾谷镰刀菌中Gpmk1上游信号感受元件的功能分析101-125
• 2.2 禾谷镰刀菌中Gpmk1下游转录因子FgSte12的功能研究125-136
• 2.3 禾谷镰刀菌中TOR信号途径与Gpmk1信号途径之间的联系136-139
• 2.4 小结与讨论139-142
• 第四章 全文结果和后续工作展望142-146
• 1. 全文结果142-144
• 2. 未来工作展望144-146
• 参考文献146-155
• 附录A：引物序列155-164
• 附录B：培养基配方164-167
• 附录C：常用试剂和试验仪器167-170
• 附录D：作者简历及攻读博士学位期间已发表论文170

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 樊平声;;小麦赤霉病和DON毒素研究进展[J];江苏农业科学;2010年05期

2 康振生,黄丽丽,H.BUCHENAUER,韩青梅,蒋选利;禾谷镰刀菌在小麦穗部侵染过程的细胞学研究[J];植物病理学报;2004年04期

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本文编号：300614