灰飞虱表皮蛋白CPR1参与水稻条纹病毒传播的功能研究

发布时间：2017-04-12 04:13

  本文关键词：灰飞虱表皮蛋白CPR1参与水稻条纹病毒传播的功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)主要是依靠介体灰飞虱以持久增殖的方式在寄主植物间进行传播,并可经卵传递给下一代灰飞虱。该病毒在介体灰飞虱内的运动和复制除了需要自身的外壳蛋白(pc3)外还需通过与介体蛋白的互作克服介体内的传播障碍,最终进入唾液腺并随唾液的分泌到达新的寄主植物来完成传播。本研究基于酵母双杂交膜系统筛选到与RSV pc3互作的大量灰飞虱蛋白为基础,从中选取了一种灰飞虱表皮蛋白CPR1进行了传毒功能的深入研究。首先克隆了CPR1的全长基因,并利用免疫共沉淀进一步验证了CPR1与RSV pc3存在显著的互作,然后通过酵母双杂交和pull down技术明确了CPR1与RSV pc3互作的结构域。qRT-PCR检测发现CPR1在灰飞虱的血淋巴内积累量最高,同时利用激光共聚焦显微镜观察到CPR1与RSV在灰飞虱的血细胞内完全共定位。为了进一步明确CPR1的传毒功能,本研究又运用RNAi技术抑制了CPR1的表达,发现RSV含量在灰飞虱的血淋巴和唾液腺内显著下降,同时传毒率也下降了50%以上。这表明CPR1与RSV的结合可能是帮助病毒逃避了寄主血淋巴的免疫作用从而保护病毒不被降解,传毒率的下降进一步说明病毒在没有CPR1的结合下含量下降,从而运输到唾液腺的量减少,所以导致传播到水稻的病毒量下降。
【关键词】：水稻条纹病毒 灰飞虱 表皮蛋白 蛋白质互作 RNA干扰
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.11
【目录】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 1 引言9-31
• 1.1 植物病毒介体昆虫传播机制的研究进展9-17
• 1.1.1 非持久和半持久性植物病毒的传毒机制研究11-12
• 1.1.2 持久性植物病毒的传毒机制研究12-17
• 1.2 水稻条纹病毒的研究进展17-24
• 1.2.1 RSV的危害及基因组结构17-20
• 1.2.2 RSV的传播介体及其传毒特点20-21
• 1.2.3 纤细病毒属病毒的传毒机制研究21-24
• 1.3 昆虫表皮蛋白的研究概况24-29
• 1.3.1 CPR家族的研究进展25-26
• 1.3.2 表皮蛋白的功能研究26-29
• 1.4 本研究的目的和意义29-31
• 2 CPR1全长基因的扩增及生物信息学分析31-39
• 2.1 材料与方法31-35
• 2.1.1 CPR1全长基因的扩增31-34
• 2.1.2 CPR1的生物信息学分析34-35
• 2.1.3 CPR1的系统进化树分析35
• 2.2 结果与分析35-38
• 2.2.1 克隆CPR1全长基因35
• 2.2.2 CPR1的生物信息学分析35-37
• 2.2.3 CPR1的系统进化树分析37-38
• 2.3 小结与讨论38-39
• 3 利用免疫共沉淀验证CPR1与RSV PC3的互作39-51
• 3.1 材料与方法39-46
• 3.1.1 RSV pc3和CPR1哺乳动物表达载体的构建39-42
• 3.1.2 RSV pc3和CPR1共转染HEK293FT细胞42-43
• 3.1.3 HEK293FT细胞的裂解43-44
• 3.1.4 化学发光Co-IP检测互作44-46
• 3.2 结果与分析46-49
• 3.2.1 RSV pc3和CPR1哺乳动物表达载体的构建46-47
• 3.2.2 RSV pc3和CPR1的表达检测47-48
• 3.2.3 RSV pc3和CPR1的化学发光Co-IP检测48-49
• 3.3 小结与讨论49-51
• 4 CPR1不同结构域与RSV PC3的互作检测51-58
• 4.1 材料与方法51-55
• 4.1.1 重组表达载体的构建51
• 4.1.2 CPR1不同结构域与RSV pc3互作的酵母双杂交检测51-54
• 4.1.3 CPR1不同结构域与RSV pc3互作的pulldown检测54-55
• 4.2 结果与分析55-58
• 4.2.1 CPR1不同结构域与RSV pc3互作的酵母双杂交检测55-58
• 5 CPR1与RSV在细胞和组织内的共定位检测58-73
• 5.1 材料与方法58-64
• 5.1.1 CPR1与RSV pc3在Sf9细胞内的共定位检测58-63
• 5.1.2 CPR1与RSV在灰飞虱细胞系内的共定位检测63
• 5.1.3 CPR1与RSV在灰飞虱不同组织的共定位检测63-64
• 5.2 结果与分析64-71
• 5.2.1 CPR1与RSV pc3在Sf9细胞内的共定位检测64-67
• 5.2.2 CPR1与RSV在灰飞虱细胞系内的共定位检测67-68
• 5.2.3 CPR1与RSV在灰飞虱不同组织的共定位检测68-71
• 5.3 小结与讨论71-73
• 6 利用RNAI抑制CPR1表达后对RSV的影响73-83
• 6.1 材料与方法73-76
• 6.1.1 CPR1 dsRNA和GFP dsRNA的合成73-74
• 6.1.2 CPR1 dsRNA和GFP dsRNA显微注射灰飞虱74-75
• 6.1.3 RNAi抑制CPR1表达后的传毒实验75-76
• 6.2 结果与分析76-81
• 6.2.1 CPR1 dsRNA和GFP dsRNA的合成76
• 6.2.2 显微注射dsRNA后CPR1和RSV的表达检测76-81
• 6.2.3 RNAi抑制CPR1表达后对RSV传毒的影响81
• 6.3 小结与讨论81-83
• 7 全文总结83-84
• 参考文献84-95
• 致谢95-96
• 博士生期间发表的学术论文96-97
• 博士后期间发表的学术论文97-98
• 个人简历98-100

  本文关键词：灰飞虱表皮蛋白CPR1参与水稻条纹病毒传播的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：300696