棉花体细胞胚发生蛋白组学分析和GhTZF1基因功能鉴定

发布时间：2017-04-13 05:08

  本文关键词：棉花体细胞胚发生蛋白组学分析和GhTZF1基因功能鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：活性氧既能作为代谢副产物对植物造成氧化伤害,又能作为信号分子调控植物生长发育和逆境响应等过程。活性氧的双重作用取决于胞内活性氧的水平。植物体具有一套完善的活性氧产生和清除系统调控着胞内的活性氧稳态平衡。在正常的生长发育过程中,植物体内活性氧的水平处于稳态平衡。但是,一些逆境因子能打破活性氧的稳态平衡,对植物造成氧化胁迫。植物体内活性氧的稳态维持对植物正常的生理代谢过程具有重要的作用。1.活性氧稳态通过生长素信号路径调控棉花体细胞胚发生体细胞胚发生是体细胞向胚性细胞转变,经历与合子胚发育相似的阶段,最终再生成完整植株的过程。体胚发生不仅是研究合子胚胎发育的良好模型,也是植物遗传转化、植株再生的有效体系。为了阐明体胚发生过程中复杂的分子事件以及控制体胚发生的因子,我们通过蛋白组学结合MADI-TOF/TOF方法,来发掘调控棉花体胚发生的相关蛋白,并探索其可能存在的分子调控机制。通过双向电泳和质谱鉴定,我们比较了棉花体胚发生过程中具有代表性的时间点/阶段(0 h,2 d,NEC,EC,GE,TE,CE)的蛋白质组。与起始时期0 h相比,我们鉴定了149个差异表达的蛋白。GO分析表明,这些差异表达的蛋白主要参与胞内代谢、刺激响应以及生长发育和生殖等过程。一些逆境相关蛋白在棉花体胚发生过程中被激活且差异表达,主要包括一些活性氧清除相关的酶,如APX、GST、SOD和硫氧还蛋白等。q RT-PCR分析表明,大部分编码活性氧清除相关蛋白的基因,其在转录水平和蛋白水平具有一致的表达模式。我们对部分编码活性氧清除相关蛋白的基因进行干涉表达,以验证这些蛋白在棉花体胚发生中的作用。将Gh APXs在棉花中干涉表达后,Gh APXs干涉系中的过氧化氢含量显著高于野生型,Gh APXs干涉系的体胚发生起始和脱分化过程被显著抑制,而胚性细胞再分化过程被促进。同样,在棉花中干涉Gh GSTL3表达后,Gh GSTL3干涉系中的过氧化氢含量高于野生型,Gh GSTL3干涉系的体胚发生起始和脱分化过程与野生型相比无明显差异,但是Gh GSTL3干涉系的再分化过程显著提前。上述结果表明,这些基因可能通过调控活性氧稳态,进而参与棉花体胚发生的调控。我们进一步通过外源添加高浓度DPI、H2O2、BSO和GSH等化学物质,以改变内源氧化还原稳态,来观察氧化还原稳态对体胚发生的影响。结果表明,氧化还原稳态破坏抑制了体细胞脱分化过程,而氧化环境则促进了胚性愈伤向体胚的转变,进一步证实了活性氧稳态参与了棉花体胚发生的调控。DPI和过氧化氢处理均导致了自由态生长素含量降低、生长素代谢改变以及生长素运输和响应相关基因的激活。抑制Gh APXs表达,同样导致了体胚发生过程中生长素代谢改变,并且,生长素运输和响应相关基因的表达与野生型相比也发生改变。这个结果显示,无论是通过化学试剂还是通过抑制活性氧清除相关蛋白的表达来改变体内活性氧稳态,均会改变体胚发生过程中的生长素稳态平衡。我们的研究表明,体胚发生激活了逆境相关基因的表达,并通过活性氧稳态和生长素信号路径动态互作来调控棉花体胚发生。2.Gh TZF1通过抑制活性氧的积累来增强植株的耐旱性和延缓叶片衰老氧化还原稳态对植物维持胞内代谢至关重要。胞内氧化还原稳态的打破会导致细胞遭受氧化伤害进而抑制植物的生长发育。在细胞壁再生SSH文库中,我们分离得到一个CCCH型串联锌指蛋白基因。通过RACE的方法,我们获得该基因的全长,并通过结构分析和聚类分析发现,该基因具有植物特有的保守锌指结构域TZF,因而将该基因命名为Gh TZF1。表达模式分析表明,Gh TZF1在细胞壁再生的早期阶段优势表达。组织表达模式分析表明,Gh TZF1在营养器官和生殖器官中均有表达,且受叶片衰老诱导表达。此外,Gh TZF1受多种非生物逆境诱导上调表达,如PEG和Na Cl等,Gh TZF1同样受茉莉酸甲酯和过氧化氢的诱导表达。在拟南芥中超表达Gh TZF1,增强了植株的耐旱性并延缓了干旱诱导的叶片衰老。进一步的实验表明,超表达Gh TZF1同样能延缓黑暗和茉莉酸甲酯诱导的叶片衰老。在干旱和茉莉酸甲酯处理下,超表达系中过氧化氢的含量均显著低于野生型。与此一致,在干旱处理条件下,活性氧清除相关的酶,如SOD和POD,其在超表达系中的酶活显著高于野生型。q RT-PCR分析表明,干旱条件下,一些氧化相关的衰老相关基因在Gh TZF1超表达系中的表达量低于野生型。进一步实验表明,超表达Gh TZF1增强了植株对氧化胁迫的耐受性。在过氧化氢处理下,超表达系中活性氧清除相关基因的表达高于野生型,衰老相关基因的表达则低于野生型。因此,我们推测,Gh TZF1可能通过调控细胞内活性氧平衡来调控植株对干旱的耐受性以及叶片衰老过程。
【关键词】：棉花 体细胞胚发生 生长素 氧化胁迫 耐旱性 叶片衰老延缓 过氧化氢 ROS GhTZF1
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S562
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 缩略词表13-15
• 第一章 文献综述15-30
• 1 植物体细胞胚发生的研究进展15-23
• 1.1 激素与体细胞胚发生16-18
• 1.1.1 生长素与体胚发生16-17
• 1.1.2 细胞分裂素与体胚发生17
• 1.1.3 脱落酸与体胚发生17-18
• 1.1.4 其他激素与体胚发生18
• 1.2 逆境胁迫与体胚发生18-19
• 1.2.1 逆境因子对体胚发生的影响18
• 1.2.2 氧化还原与体胚发生18-19
• 1.3 体细胞胚发生的分子机理研究19-23
• 1.3.1 体胚发生相关基因的研究19-21
• 1.3.2 体胚发生的蛋白质组学研究21-23
• 2 GhTZF1 在抗旱中的功能研究23-29
• 2.1 干旱对植物生长的影响23
• 2.2 植物对干旱胁迫响应类型23-24
• 2.3 植物抵御干旱胁迫的生理机制24-25
• 2.3.1 活性氧清除系统的启动24
• 2.3.2 维持水分代谢24
• 2.3.3 渗透调节24
• 2.3.4 增强根系活力24-25
• 2.3.5 增加光合速率25
• 2.4 植物响应干旱的分子机制25-26
• 2.4.1 依赖于ABA的信号转导途径25-26
• 2.4.2 非依赖于ABA的信号转导途径26
• 2.5 干旱与叶片衰老26-27
• 2.5.1 影响叶片衰老的因素26
• 2.5.2 干旱与叶片衰老的关系26-27
• 2.6 CCCH型锌指蛋白研究进展27-29
• 2.6.1 锌指蛋白的分类和结构特征27-28
• 2.6.2 CCCH型锌指蛋白的功能研究进展28-29
• 3 本研究的目的和意义29-30
• 第二章 棉花体胚发生的蛋白质组学分析30-63
• 1 材料和方法31-38
• 1.1 实验材料31
• 1.2 实验方法31-38
• 1.2.1 棉花体胚发生的蛋白质组学分析31-34
• 1.2.2 GhAPXs和GhGSTL3 在体胚发生中的功能研究34
• 1.2.3 改变活性氧稳态的相关处理34-35
• 1.2.4 活性氧的定性分析及过氧化氢的测定35-36
• 1.2.5 生长素及生长素代谢物的提取和测定36
• 1.2.6 RNA提取，RT-PCR和qRT-PCR分析36-38
• 2 结果与分析38-58
• 2.1 棉花体胚发生的蛋白表达谱分析38-43
• 2.1.1 棉花体胚发生不同时期的形态学38
• 2.1.2 棉花体胚发生过程的蛋白表达谱38-40
• 2.1.3 差异表达蛋白的鉴定及功能分类40-41
• 2.1.4 棉花体胚发生过程中与氧化还原相关的差异表达蛋白分析41-43
• 2.2 GhAPXs抑制表达加快非胚性愈伤向胚性愈伤转化过程43-45
• 2.3 抑制GhGSTL3 的表达促进了棉花体胚发生的再分化过程45-47
• 2.4 活性氧（ROS）稳态平衡调控体胚发生过程47-53
• 2.4.1 扰乱活性氧稳态平衡抑制脱分化过程47-53
• 2.4.2 氧化环境促进体胚发生再分化过程53
• 2.5 体胚发生过程中活性氧稳态负调控生长素平衡53-56
• 2.5.1 DPI和H2O2处理打破了体胚发生过程中生长素的动态平衡53
• 2.5.2 干涉GhAPXs的表达改变了体胚发生过程中生长素代谢53-55
• 2.5.3 活性氧对生长素运输及信号路径的影响55-56
• 2.5.4 外源施加生长素能部分恢复DPI和H2O2导致的体胚发生受阻56
• 2.6 生长素与ROS共同调控棉花体胚发生56-58
• 3 讨论58-63
• 第三章 GhTZF1 基因的克隆及其在抗旱中的功能鉴定63-89
• 1 实验材料与方法63-71
• 1.1 实验材料63
• 1.2 菌株和载体63
• 1.3 实验方法63-71
• 1.3.1 材料处理及cDNA模板制备63-64
• 1.3.2 基因克隆、载体构建及转化64-67
• 1.3.3 基因生物信息学分析67
• 1.3.4 RT-PCR和qRT-PCR67
• 1.3.5 转基因拟南芥PEG处理67
• 1.3.6 转基因材料的干旱处理67-68
• 1.3.7 离体叶片衰老诱导68
• 1.3.8 H2O2处理68
• 1.3.9 过氧化氢、叶绿素和丙二醛（MDA）含量的测定68-69
• 1.3.10 酶活测定69-71
• 1.3.11 统计分析71
• 2 结果与分析71-85
• 2.1 GhTZF1 基因的克隆和序列分析71-74
• 2.2 GhTZF1 基因的表达模式分析74-76
• 2.2.1 GhTZF1 的组织表达模式分析74
• 2.2.2 GhTZF1 在非生物胁迫下的表达模式分析74-76
• 2.3 超表达 GhTZF1 增强了植株的耐旱性76-80
• 2.3.1 GhTZF1 及其拟南芥同源基因的表达量检测76
• 2.3.2 超表达GhTZF1 增强了对PEG的耐受性76-78
• 2.3.3 超表达GhTZF1 增强了植株耐旱性且延缓了干旱诱导的叶片衰老78-79
• 2.3.4 超表达GhTZF1 提高了SOD和POD酶活79-80
• 2.4 活性氧稳态相关基因和逆境诱导衰老相关基因的表达80-82
• 2.5 超表达GhTZF1 延缓了黑暗、MeJA诱导的叶片衰老82-84
• 2.5.1 超表达GhTZF1 延缓了黑暗诱导的叶片衰老82-83
• 2.5.2 超表达GhTZF1 延缓了MeJA诱导的叶片衰老83-84
• 2.6 GhTZF1 增强了对过氧化氢的耐受性84-85
• 3 讨论85-89
• 3.1 GhTZF1 是联系抗旱性和叶片衰老延缓之间的纽带85-87
• 3.2 GhTZF1 通过抑制活性氧的生成和积累来增强植株抗旱性和延缓叶片衰老 7387-89
• 参考文献89-107
• 附录107-142
• 攻读学位期间已发表和待发表论文142-143
• 国家专利143-144
• 致谢144-146

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 张原根，程林梅，阎继耀，牛永章;棉属种间杂交抗旱种质材料生理特性的研究[J];棉花学报;1995年01期

2 陈金慧,施季森,诸葛强,黄敏仁;植物体细胞胚胎发生机理的研究进展[J];南京林业大学学报(自然科学版);2003年01期

3 张宝红，李秀兰，李凤莲，王武，，李付广;棉花优良新品种泗棉3号高频体细胞胚发生和植株再生的研究[J];西北农业学报;1995年04期

4 赖呈纯;赖钟雄;方智振;何园;姜顺日;;龙眼体细胞胚发生早期的蛋白质组学[J];中国农业科学;2012年09期

5 Miroslav Kaminek;Petre Dobrev;Wilhelm Gruissem;;Senescence-Inducible Expression of Isopentenyl Transferase Extends Leaf Life,Increases Drought Stress Resistance and Alters Cytokinin Metabolism in Cassava[J];Journal of Integrative Plant Biology;2010年07期

6 陈以峰,周燮,汤日圣,张金渝,梅传生;水稻体细胞培养中胚性细胞出现与IAA的关系[J];植物学报;1998年05期

7 Zhenzhen Xu;Chaojun Zhang;Xueyan Zhang;Chuanliang Liu;Zhixia Wu;Zuoren Yang;Kehai Zhou;Xiaojie Yang;Fuguang Li;;Transcriptome Profiling Reveals Auxin and Cytokinin Regulating Somatic Embryogenesis in Different Sister Lines of Cotton Cultivar CCRI24[J];Journal of Integrative Plant Biology;2013年07期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 曾范昌;棉花体细胞胚发生与合子胚发育相关基因的鉴定、克隆与功能分析[D];华中农业大学;2007年

2 曹景林;棉花体胚同步发生及相关基因表达和蛋白磷酸化分析[D];华中农业大学;2008年

  本文关键词：棉花体细胞胚发生蛋白组学分析和GhTZF1基因功能鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：302860