水稻蔗糖转运蛋白OsSUT4的功能分析

发布时间：2021-02-26 18:18

　　蔗糖作为光合作用的终产物和同化物长距离运输的主要形式,其自源端合成后经由韧皮部转运至库端需要蔗糖转运蛋白（SUT）的参与。同化物在“源”和“库”之间的流动由“源强”和“库强”二者共同决定。同化物在不同的库组织之间的分配决定了各器官的发育程度和最终产量因素的形成,而蔗糖的运输产生的动力亦可以推动其它光合产物在韧皮部的运输。目前,有研究报道SUT作为蔗糖运输载体,在蔗糖进出韧皮部、库组织蔗糖供给、蔗糖贮存、蔗糖转运调控以及其它小分子物质转运等多种生理过程中发挥重要作用。此外,前人的研究已证实有的蔗糖转运蛋白参与生长发育和种子灌浆过程,而关于蔗糖转运蛋白如何影响同化物在库端的卸载和分配却鲜有报道。在本研究中,以“日本晴”为材料,利用CRISPR/Cas9技术获得了OsSUT4基因突变株并对其功能进行了探索。根据OsSUT4的核酸序列（GenBank序列号:AB091673.1）,设计CDS上的靶标并构建载体,转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织,经分化和再生获得OsSUT4基因编辑植株。三代以上连续自交后去除Cas9蛋白的遗传背景并获得纯合突变体。构建OsSUT4-GFP重组质粒,并在洋葱鳞片叶表皮... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：114 页

【学位级别】：博士

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符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 蔗糖的代谢
        1.1.1 蔗糖的生物学合成
            1.1.1.1 碳的固定
            1.1.1.2 磷酸丙糖输出叶绿体
            1.1.1.3 蔗糖的合成
        1.1.2 蔗糖的分解
    1.2 蔗糖在植物体内的运输
        1.2.1 蔗糖的运输过程
            1.2.1.1 蔗糖在细胞内的运输
            1.2.1.2 蔗糖在细胞间的运输过程
        1.2.2 蔗糖转运载体
    1.3 蔗糖转运蛋白
        1.3.1 SUT蛋白的分类
        1.3.2 SUT蛋白的结构
        1.3.3 SUT蛋白的定位
            1.3.3.1 亚细胞定位
            1.3.3.2 组织特异性
        1.3.4 SUT蛋白的研究进展
            1.3.4.1 质膜定位的SUTs
            1.3.4.2 液泡膜定位的SUTs
    1.4 水稻的幼穗发育
        1.4.1 幼穗发育的过程
        1.4.2 幼穗发育的影响因素
        1.4.3 糖分供应与幼穗发育
    1.5 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 材料的培养
        2.1.3 菌株与质粒
        2.1.4 生化试剂及酶制剂
        2.1.5 耗材
        2.1.6 PCR引物
        2.1.7 培养基
        2.1.8 分析软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 CRISPR/Cas9载体构建
        2.2.2 质粒提取
        2.2.3 根癌农杆菌感受态细胞的制备
        2.2.4 冻融法转化根癌农杆菌
        2.2.5 水稻愈伤组织培养和转化
            2.2.5.1 愈伤组织诱导
            2.2.5.2 愈伤组织继代培养
            2.2.5.3 根癌农杆菌培养
            2.2.5.4 愈伤组织转化-预培养
            2.2.5.5 愈伤组织转化-侵染
            2.2.5.6 愈伤组织转化-共培养
            2.2.5.7 愈伤组织转化-筛选培养
            2.2.5.8 愈伤组织转化-抗性愈伤组织再分化
            2.2.5.9 愈伤组织转化-再生苗生根和壮苗
        2.2.6 CRISPR/Cas9基因编辑水稻的DNA水平鉴定
            2.2.6.1 SDS法提取水稻基因组DNA
            2.2.6.2 PCR扩增并测序
        2.2.7 p Os SUT4::GUS表达载体的构建
        2.2.8 基因表达量检测
            2.2.8.1 水稻总RNA提取（TRIZOL试剂法）
            2.2.8.2 RNA琼脂糖变性凝胶电泳检测
            2.2.8.3 RNA浓度测定
            2.2.8.4 反转录反应
            2.2.8.5 c DNA质量检测
            2.2.8.6 实时荧光定量PCR
        2.2.9 Os SUT4瞬时表达载体构建
        2.2.10 农杆菌介导的洋葱鳞片叶表皮细胞转化
        2.2.11 Os SUT4抗体制备
            2.2.11.1 Os SUT4人工多肽抗体制备
            2.2.11.2 GST- Os SUT4重组蛋白表达
            2.2.11.3 GST-Os SUT4重组蛋白小量诱导表达
            2.2.11.4 SDS-PAGE电泳
            2.2.11.5 考马斯亮蓝凝胶染色
            2.2.11.6 GST-Os SUT4重组蛋白大量诱导表达
            2.2.11.7 GST- Os SUT4重组蛋白纯化
            2.2.11.8 蛋白浓度测定
            2.2.11.9 重组蛋白免疫家兔
        2.2.12 Western blot
            2.2.12.1 水稻全蛋白提取
            2.2.12.2 SDS-PAGE电泳
            2.2.12.3 湿法转膜
            2.2.12.4 封闭
            2.2.12.5 免疫反应
            2.2.12.6 ECL化学发光
        2.2.13 扫描电镜样品制备
        2.2.14 水稻生理指标测定
            2.2.14.1 蔗糖含量测定
            2.2.14.2 葡萄糖含量测定
            2.2.14.3 果糖含量测定
            2.2.14.4 淀粉含量测定
        2.2.15 光合作用相关参数测定
2同化速率的测定">            2.2.15.1 水稻叶片CO₂同化速率的测定
            2.2.15.2 水稻叶片叶绿素荧光参数的测定
            2.2.15.3 水稻叶片P700还原态的测定
            2.2.15.4 叶绿素含量测定
        2.2.16 水稻生物量测定
        2.2.17 GUS染色
13CO₂标记">        2.2.18 稳定同位素¹³CO₂标记
        2.2.19 糖分输出试验
        2.2.20 水稻农艺性状统计和稻米品质分析
        2.2.21 Os SUT4的转运活性检测
            2.2.21.1 酵母表达载体的构建
            2.2.21.2 乙酸锂法制备酵母感受态细胞
            2.2.21.3 酵母感受态细胞的转化
            2.2.21.4 酵母体系蔗糖吸收活性测定
            2.2.21.5 蔗糖转运的质子依赖性测定
            2.2.21.6 蔗糖吸收动力学测定
        2.2.22 转录组测序
3 结果与分析
    3.1 农杆菌介导法获得ossut4突变体
        3.1.1 Cas9/g RNA-Os SUT4载体构建
        3.1.2 ossut4突变体的获得
        3.1.3 ossut4突变体的鉴定
        3.1.4 ossut4突变体互补株系的获得与鉴定
    3.2 Os SUT4蛋白的亚细胞定位
    3.3 Os SUT4的组织表达特异性
        3.3.1 GUS染色
        3.3.2 实时荧光定量PCR检测Os SUT4表达量
        3.3.3 Os SUT4的表达受蔗糖诱导
    3.4 Os SUT4影响水稻幼穗发育
        3.4.1 幼穗发育状态滞后于野生型
        3.4.2 幼穗分化初期突变体幼穗中糖分含量不足
        3.4.3 幼穗分化初期突变体幼茎中糖分过量积累
        3.4.4 幼穗分化初期突变体中同化物分配失衡
        3.4.5 幼穗中蔗糖转运相关基因表达情况
    3.5 Os SUT4影响水稻产量
        3.5.1 稻穗变短、一次枝梗减少
        3.5.2 小区实际产量减少
        3.5.3 其它性状统计
    3.6 Os SUT4影响水稻营养生长
        3.6.1 幼苗生长受抑制
        3.6.2 成苗营养器官生长不足
        3.6.3 突变体水稻生物量积累减少
        3.6.4 ossut4突变体贪青晚熟
    3.7 Os SUT4影响水稻灌浆
        3.7.1 ossut4突变体灌浆周期延长
        3.7.2 ossut4突变体糙米品质下降
        3.7.3 ossut4-6 突变体中Os GBSSⅠ 活性增强
        3.7.4 Os SUT4影响灌浆期内茎秆中非结构性碳的代谢
    3.8 Os SUT4不影响光合产物合成
2同化速率与野生型无差异">        3.8.1 成熟前突变体的CO₂同化速率与野生型无差异
        3.8.2 PSⅡ 和PSⅠ 的活性均未受影响
    3.9 转录组分析
4 讨论
    4.1 Os SUT4影响水稻营养生长
    4.2 Os SUT4影响水稻幼穗发育
    4.3 Os SUT4影响水稻产量
    4.4 Os SUT4影响稻米品质
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]超表达蔗糖转运蛋白基因OsSUT1对水稻形态和生理的影响[J]. 冯冰,孙雅菲,艾昊,刘秀丽,杨晶,刘璐,高飞燕,徐国华,孙淑斌.  中国水稻科学. 2018(06)
[2]水稻幼穗-颖花发育的研究进展[J]. 姜树坤,张喜娟,王嘉宇,张凤鸣.  植物遗传资源学报. 2012(06)
[3]C4水稻,我们的新挑战（英文）[J]. 李圆圆,张慧,朱新广.  植物生理学报. 2011(12)
[4]水稻幼穗发育过程的扫描电镜观察——Ⅰ、不同粒位小穗分化进度的差异与籽粒性状的关系[J]. 陈国珍,孔宪扬.  作物学报. 1987(02)



本文编号：3052977