马铃薯晚疫病菌RxLR效应蛋白与寄主蛋白互作促进侵染的机制研究

发布时间：2017-04-14 17:10

  本文关键词：马铃薯晚疫病菌RxLR效应蛋白与寄主蛋白互作促进侵染的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：马铃薯晚疫病(Potato Late Blight)由致病疫霉菌P.infestans引起,该病害在适宜的环境条件下能快速发展造成病害流行,是一种毁灭性的卵菌病害。生产上,防控马铃薯晚疫病最有效的手段是种植抗病品种,但是由于该病病原菌P.infestans不断发生毒性变异,经常导致作物品种抗性的丧失,病害呈周期性流行和爆发。在晚疫病菌侵染寄主的过程中,该病原菌与寄主发生互作,植物体产生免疫反应,这包括复杂的交叉-结合的信号传输网和信号调节过程。植物诱导防御的第一个阶段包括对保守微生物分子的认知(病原菌相关分子模式;PAMPs),或者由于细胞的损伤而产生的分子(DAMPs)的识别,导致防御通道的激活,这一过程被称为跨膜识别受体触发的防卫反应(PTI)。寄主的特异性病原物则逐步地操纵和抑制PTI,来提高植物感病性。效应蛋白(Effector),是植物病原微生物在与寄主植物互作过程中分泌的、可被植物NBS-LRR抗性蛋白特异识别、兼具毒性与无毒性功能的蛋白,是病原物用于抑制PTI的策略之一。因此,鉴定效应蛋白及与它们互作的寄主靶蛋白,以及研究效应蛋白操纵寄主使植物感病机制是当前研究的一个重点。本论文以致病疫霉菌(Phytophthora infestans)分泌的定位在细胞核上的重要效应蛋白PexRD41为研究对象,该效应蛋白的基因地址是04089,因此本研究通称PITG_04089(Pi04089),获得的研究结果如下:(1)通过在Pi04089基因序列的N端融合绿色荧光蛋白GFP,介导农杆菌后转染模式植物本氏烟,接种马铃薯晚疫病菌,与对照GFP空载体相比,显著促进了马铃薯晚疫病的侵染。借助共聚焦荧光显微镜Confocal进行活体观察,确定了PITG_04089蛋白显著地定位于细胞核,在细胞核核仁周围形成一个环。被测RxLR效应蛋白PITG_04089(Pi04089)基因表达量在晚疫病菌侵染的早期阶段(24h和48h)出现显著的基因上调,这种上调作用甚至可以持续到72h。(2)为了验证核仁在Pi04089行使功能中的作用,本研究在GFP-040894 N端加入出核信号NES,形成NESGFP-Pi04089融合蛋白,经confocal观察,GFP绿色荧光蛋白在细胞核仁中显著减少,同时细胞质中的绿色荧光显著增强,说明该信号将GFP-Pi04089极大地运出细胞核。在本氏烟上进行ATTA实验,瞬时表达GFP-Pi04089和NESGFP-Pi04089后接种晚疫病菌,病斑测量值进行方差实验,结果显示与GFP-Pi04089相比,修饰后的NESGFP-Pi04089显著地降低了晚疫病菌的侵染水平,大大削弱了效应蛋白Pi04089对晚疫病的侵染,表明细胞核是Pi04089在植物体内实现功能的重要部位。(3)为了筛选Pi04089在植物体内的互作靶蛋白,实验室构建了马铃薯晚疫病菌酵母双杂交库,cDNA文库材料来自于P.infestans侵染15h和72h的马铃薯植株病组织,从酵母双杂交系统中筛选到Pi04089在寄主中的靶蛋白为含3个KH结构域的RNA结合蛋白KRBP1(命名为StKRBP1)。此外,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术,也验证了StKRBP1与Pi04089在植物体内的互作关系。(4)通过双分子荧光互补(BiFC)技术,发现Pi04089与KRBP1互作发生在细胞核内,免疫印迹western blotting实验证实了这些蛋白组合在植物中稳定存在。当Pi04089与KRBP1在本氏烟共表达(co-expression)时,Pi04089原先在细胞核核仁的环消失,定位因KRBP1的存在而改变,该效应蛋白定位到与KRBP1相同的细胞核核斑点上。在两者共表达植株上接种晚疫病菌,发现在病原菌早期侵染阶段(24h),KRBP1蛋白表达量显著提高,因此证明了KRBP1对晚疫病菌侵染起正调节的作用。(5)利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术,将KHRBPs的保守基序GxxG突变为GDDG,构建了2个VIGS突变体StKRBP1mut。通过酵母双杂交和免疫共沉淀技术,证明该突变体与Pi04089在酵母和植物体内不再互作。突变体阻止了Pi04089在核斑点上的定位,StKRBP1mut蛋白表达量也没有增加。(6)突变体StKRBP1mut不再帮助晚疫病菌提高对叶片的侵染,这表明核苷酸结合位点对效应蛋白Pi04089与KRBP1互作是必要的。研究结果显示KRBP1是一个感病因子(Susceptibility Factor),效应蛋白Pi04089可能修饰或增强了KRBP1的活性,与KRBP协作提高病原菌侵染。
【关键词】：马铃薯晚疫病 致病疫霉 RxLR效应蛋白 互作 KH RNA结合蛋白(KHRBP)
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.32
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-33
• 1.1 马铃薯晚疫病的发生与危害及其病原特性12-19
• 1.1.1 晚疫病对马铃薯的危害12-13
• 1.1.2 马铃薯晚疫病的田间症状及流行规律13-14
• 1.1.3 致病疫霉菌P.infestans分类地位14
• 1.1.4 致病疫霉菌P.infestans形态学特性14-15
• 1.1.5 P.infestans侵染过程中的细胞生物学特性15-17
• 1.1.6 致病疫霉菌的侵染循环和生活史17-18
• 1.1.7 晚疫病菌的群体变异18-19
• 1.2 病原与寄主互作分子机理19-24
• 1.2.1 病原与寄主互作概念19-20
• 1.2.2 植物免疫与抗病性20-21
• 1.2.3 植物的抗病性21-24
• 1.3 效应蛋白种类及其研究进展24-30
• 1.3.1 质外体效应蛋白（Apoplastic effectors）25-27
• 1.3.2 细胞质效应蛋白（Cytoplasmic effectors）27-30
• 1.4 P.infestans RxLR效应蛋白与寄主互作及其功能30-31
• 1.4.1 PiAVR3a与CMPG1互作，抑制INFI诱导的细胞死亡30-31
• 1.4.2 PiAvr4与抗性基因R4互作，引起植物防卫反应，表现无毒活性31
• 1.4.3 PiAvrblb1与LerRK1.9 互作，影响植物抗性31
• 1.4.4 PITG_03192与NTP1和NTP2互作，，抑制晚疫病菌的侵染31
• 1.5 致病疫霉效应蛋白RxLR在侵染阶段具有不同的表达模式31-32
• 1.6 本研究的目的意义32-33
• 2 材料与方法33-47
• 2.1 材料33
• 2.1.1 供试菌株33
• 2.1.2 晚疫病菌培养基33
• 2.1.3 供试植株33
• 2.2 方法33-47
• 2.2.1 黑麦培养基制作方法33-34
• 2.2.2 晚疫病菌菌株保存及复壮34
• 2.2.3 P. infestans孢子悬浮液的制备34
• 2.2.4 P. infestans孢子悬浮液活体接种供试植物34
• 2.2.5 基因瞬时表达34-35
• 2.2.6 农杆菌瞬时表达接种晚疫病菌分析实验（ATTA）35-36
• 2.2.7 载体构建、基因克隆及农杆菌转化36-39
• 2.2.8 共聚焦成像及图片处理39-40
• 2.2.9 叶片组织总RNA抽提40-41
• 2.2.10 DNase处理41
• 2.2.11 cDNA合成41
• 2.2.12蛋白质-蛋白质互作技术寻找Pi04089在寄主中的靶蛋白41-43
• 2.2.13基因表达分析43-44
• 2.2.14病毒诱导基因沉默（Virus Induced Gene Silencing，VIGS）44-45
• 2.2.15 Western blot检测蛋白45-47
• 3 结果与分析47-69
• 3.1 Pi04089在植物体内的功能鉴定与研究47-55
• 3.1.1 瞬时表达Pi04089基因，显著促进晚疫病菌侵染47-48
• 3.1.2 Pi04089在植物体内的亚细胞定位48-50
• 3.1.3 Pi04089在寄主细胞核仁中发挥作用，促进晚疫病菌侵染50-54
• 3.1.4 在晚疫病菌侵染早期阶段，Pi04089表达量上调54-55
• 3.2 利用多项蛋白互作技术，寻找Pi04089的互作寄主靶蛋白55-60
• 3.2.1 酵母双杂交技术（Yeast-Two-Hybrid）55-56
• 3.2.2 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）技术56-58
• 3.2.3 双分子荧光互补实验证明St KRBP1与Pi04089的互作关系58-60
• 3.3 Pi04089寄主互作靶蛋白StKRBP1的功能研究60-64
• 3.3.1 StKRBP1在植物体内的亚细胞定位60
• 3.3.2 StKRBP1与Pi04089发生互作的亚细胞区域60-61
• 3.3.3 超量表达（overexpression）StKRBP1促进晚疫病菌生长61-62
• 3.3.4 在侵染早期阶段，StKRBP1因Pi04089在植物体内稳定存在62-64
• 3.4 StKRBP1突变体构建及其功能研究64-69
• 3.4.1 StKRBP1突变体构建64
• 3.4.2 StKRBP1突变体与Pi04089互作消失64-65
• 3.4.3 StKRBP1突变体的亚细胞定位65-66
• 3.4.4 StKRBP1突变体与Pi04089在本氏烟中共表达66
• 3.4.5 StKRBP1突变体不再促进晚疫病菌的侵染66-69
• 4 讨论69-74
• 4.1 效应蛋白Pi04089的研究价值69
• 4.2 效应蛋白Pi04089在植物体内的亚细胞定位69
• 4.3 核定位信号的应用效果69
• 4.4 三项蛋白互作技术寻找Pi04089的寄主互作靶蛋白69-70
• 4.5 靶蛋白StKRBP1的功能研究及进展70-72
• 4.6 基因敲除靶蛋白StKRBP172
• 4.7 效应蛋白Pi04089和StKRBP1互作功能研究72-74
• 5 结论74-75
• 论文创新点75-76
• 致谢76-77
• 参考文献77-89
• 附录89-95
• 攻读博士学位期间发表的学术论文95

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  本文关键词：马铃薯晚疫病菌RxLR效应蛋白与寄主蛋白互作促进侵染的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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