文昌鱼CAL和斑马鱼PTX的晶体结构与进化机制研究

发布时间：2017-04-17 05:01

  本文关键词：文昌鱼CAL和斑马鱼PTX的晶体结构与进化机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：获得性免疫系统—以多样性的抗原受体(BCRs和TCRs)、淋巴细胞、各种重组机制为特征一起源于5亿年前的软骨鱼。迄今为止,由于经典获得性免疫系统的所有组分都发现于有颌类及以后的物种,使得探讨以TCR-BCR为基础的获得性免疫系统的起源成为了一个难题。然而,BCRs和TCRs共同具有的抗原识别功能域,即免疫球蛋白超家族功能域V (IgSF-V)、同样的重组机制及其最低等有颌脊椎动物如鲨鱼基因组中的紧密连锁、使进化学者达成了基本共识：BCRs和TCRs共同起源于更低等脊索动物中的一个具有IgSF功能域的祖先基因。聚焦于脊椎动物的祖先—头索动物文昌鱼,其全基因组测序于2008年完成,结果进一步证实它是全基因组2次复制前公认的、最古老的活化石物种。因此,在文昌鱼中寻找IgSF-V分子,解析其结构、分析相关功能,既可反映出IgSF共同祖先分子(CAL)的特征,又可独辟蹊径的阐释获得性免疫系统的起源。 短链五聚素(PTX)为非特异免疫系统中的关键分子,其功能类似于抗体,既能与Clq结合、通过经典途径激活补体系统,又能与FcR结合引发免疫溶菌和调理吞噬效率。斑马鱼具有上述分子和细胞,是研究PTX在低等脊椎动物中的结构及其与特异性免疫分子之间互作机制的最好对象。因此,本文对文昌鱼CAL和斑马鱼PTX两个进化节点相关蛋白的晶体结构进行了解析,并集成了生物信息学、分子免疫学与结构生物学技术对其功能进行了阐释。 首先,在文昌鱼基因组和转录组中发现了-IgSF-V共同祖先样分子CAL。解析其基因组构造发现,CAL位于文昌鱼免疫功能相关基因域,令人惊讶的是在CAL的内含子2、3和4中均存在RSS-like序列,并且,其跨膜区域存在保守的抗原受体跨膜区序列(CART motif)。随后,对CAL进行了表达、纯化与结晶。CAL晶体结构解析结果显示,CAL蛋白由两个独立的lg功能域组成,形成了一个IgV和IgC串联的结构,这是迄今为止解析的最古老的IgV-C分子。CAL具备典型的获得性免疫受体的结构特征—典型的IgV结构域、多样性的CDR-loop、J链样基序和结构(β-bulge)及3-layer packing的二聚体方式等。组织定位显示,CAL主要在原始的鳃、肠道和肝盲囊表达,并且都位于易于与外界微生物接触的腔面。肠道亚细胞定位显示,CAL主要分布在纤毛、细胞表面凸起、分泌性颗粒等具有免疫功能的亚细胞结构。 另外,通过解析斑马鱼PTX (Dare-PTX)及Dare-PTX-Ca的晶体结构,发现Dare-PTX是一个三聚体,其结构是在五聚素家族中发现的一新聚合方式。与人PTX相比,在Dare-PTX的配体识别面,Dare-PTX具有深而窄的抗原结合口袋。在Dare-PTX的效应面,Dare-PTX具有一个新的C1q的结合模式及部分保守的FcR的结合位点。 综上所述,本文通过对CAL的研究,发现了文昌鱼体内存在一个与免疫相关的具有体细胞突变的IgV-C分子,其精细结构具有获得性免疫受体的典型结构特征,并具备免疫受体的基因组元件。结果将有助于我们更好地理解获得性免疫的起源与进化。斑马鱼PTX的结构展示了一个起源于4.5亿年前的硬骨鱼的PTX精细结构及其获得性免疫系统的协同进化关系。
【关键词】：共同的祖先样分子 短链五聚素 获得性免疫受体 进化 晶体结构
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 目录7-10
• 插图和附表清单10-13
• 缩略词表13-15
• 第一章 引言15-38
• 1 国内外研究进展15-36
• 1.1 免疫进化领域的研究进展15-27
• 1.2 文昌鱼的进化地位与其免疫学的研究现状27-31
• 1.3 短链五聚素PTX的研究进展31-36
• 2 研究目的与意义36-37
• 3 研究内容和技术路线37-38
• 3.1 研究内容37
• 3.2 技术路线37-38
• 第二章 CAL分子的基因组构造与体细胞突变解析38-55
• 1 引言38-39
• 2 材料39-41
• 2.1 文昌鱼39
• 2.2 载体与菌株39
• 2.3 常规分子生物学试剂39
• 2.4 主要仪器设备39
• 2.5 常用溶液及配制39-41
• 3 方法41-45
• 3.1 CAL分子的基因构造与生物信息学分析41-42
• 3.2 文昌鱼总RNA的提取42
• 3.3 CAL分子克隆42-45
• 4 结果45-53
• 4.1 CAL基因在佛罗里达文昌鱼基因组的构造45-46
• 4.2 CAL的生物信息学分析46-49
• 4.3 CAL在中国文昌鱼的体细胞突变解析49-53
• 5 讨论53-54
• 5.1 CAL的基因组构造53
• 5.2 CAL的体细胞突变机制53-54
• 6 小结54-55
• 第三章 文昌鱼CAL分子晶体结构研究55-83
• 1 引言55-56
• 2 材料56-62
• 2.1 CAL基因合成56
• 2.2 载体与菌株56
• 2.3 常规分子生物学试剂56
• 2.4 主要仪器设备56-57
• 2.5 常用溶液及配制57-62
• 3 方法62-67
• 3.1 CAL/pET21a表达载体的构建62
• 3.2 CAL分子的表达62-63
• 3.3 CAL-V基因的亚克隆与表达63-64
• 3.4 CAL和CAL-V包涵体的提取64
• 3.5 CAL和CAL-V的复性与纯化64-65
• 3.6 CAL和CAL-V的蛋白结晶65-66
• 3.7 CAL和CAL-V结构的分析66-67
• 4 结果67-81
• 4.1 CAL和CAL-V表达载体的构建67-68
• 4.2 CAL和CAL-V的纯化68-70
• 4.3 CAL和CAL-V的结晶70
• 4.4 CAL和CAL-V晶体的衍射及结构解析70-71
• 4.5 CAL和CAL-V结构分析71-81
• 5 讨论81-82
• 6 小结82-83
• 第四章 文昌鱼CAL分子的组织及亚细胞定位83-92
• 1 引言83-84
• 2 材料84-85
• 2.1 文昌鱼84
• 2.2 鼠抗CAL的单克隆抗体制备84
• 2.3 常规分子生物学试剂84
• 2.4 主要仪器设备84
• 2.5 常用溶液及配制84-85
• 3 方法85-87
• 3.1 CAL蛋白及其单抗的纯化85
• 3.2 CAL的组织定位85
• 3.3 CAL的亚细胞结构定位85-87
• 4 结果87-90
• 4.1 抗CAL的单克隆抗体的纯化87
• 4.2 CAL的组织定位及肠道的亚细胞结构定位87-90
• 5 讨论90-91
• 6 小结91-92
• 第五章 斑马鱼CRP晶体结构研究92-121
• 1 引言92-93
• 2 材料93
• 2.1 斑马鱼93
• 2.2 载体、菌株、试剂与试剂盒93
• 2.3 主要仪器设备93
• 2.5 常用试剂及配制方法93
• 3 实验方法93-96
• 3.1 Dare-PTX分子的克隆93-94
• 3.2 Dare-PTX 的表达94
• 3.3 Dare-PTX蛋白的复性及纯化94
• 3.4 Dare-PTX蛋白的结晶94-95
• 3.5 Dare-PTX分子结构的解析95
• 3.6 Dare-PTX蛋白的分析超速离心95-96
• 4. 结果96-117
• 4.1 Dare-PTX的克隆96-97
• 4.2 Dare-PTX的表达97-100
• 4.3 Dare-PTX的纯化100
• 4.4 Dare-PTX的分析超速离心100-101
• 4.5 Dare-PTX的结晶101-102
• 4.6 Dare-PTX和Dare-PTX-Ca的结构分析102-117
• 5 讨论117-120
• 6 小结120-121
• 第六章 结论和创新点121-123
• 1. 结论121
• 2. 创新点121-123
• 参考文献123-131
• 致谢131-133
• 个人简历133-134

【共引文献】

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  本文关键词：文昌鱼CAL和斑马鱼PTX的晶体结构与进化机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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