藏猪肠道细菌群落组成与纤维素分解菌的研究

发布时间：2017-04-17 06:01

  本文关键词：藏猪肠道细菌群落组成与纤维素分解菌的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：养猪业是我国耗粮性最大的畜牧业,研究我国一些优良地方猪种耐粗饲的生物学特性,对于培育节粮型新猪种,发展节粮性养猪业具有重要意义。藏猪是生长在我国青藏高原,可以终年放牧,以草为主进行饲养的地方特色品种,其食草性、抗寒性、抗病性、芳香性、环保性等优良特性备受国内外研究者的关注。藏猪的食草特性必然与其肠道独特的微生物密切相关。为了揭示藏猪的食草特性,本研究对藏猪胃肠道的细菌群落组成与多样性、纤维素分解菌的分离筛选、纤维素酶的酶学特性、纤维素酶的生产、纤维素酶基因的克隆以及纤维素分解菌的益生评定等方面进行了比较系统的研究,结果如下:1、采用DGGE方法研究藏猪胃肠道中的细菌群落组成及多样性,发现藏猪盲肠中细菌的种类最为丰富,其次为胃、回肠、空肠和十二指肠。藏猪胃肠道中的细菌分别属于Bacteroidetes、Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Spirochaetes,其中61%属于新种,并且不同的肠段其优势菌不同。通过对藏猪和瘦肉型猪盲肠中的细菌群落组成及多样性分析,发现藏猪盲肠中的细菌更具有多样性,不同个体间盲肠中的细菌群落组成的相似性达到80%以上,而瘦肉型猪则为65%。藏猪DGGE图谱中的特异性DNA条带以及DNA的丰度也均高于瘦肉型猪。Bacteroidetes和Firmicutes均为两个猪种的优势菌门,但Bacteroidetes的丰富度远远高于Firmicutes。此外,在两个猪种的盲肠中均发现了多种与纤维降解相关的细菌,如Prevotella、Ruminiclostridium、Anaerovibrio、Sphaerochaeta,Bacteroides、Parabacteroides,但藏猪盲肠中的纤维素分解菌比瘦肉型猪高11.2%。2、采用Illumina Miseq高通量测序技术研究两个猪种盲肠中的细菌群落组成及多样性,发现从藏猪和瘦肉型猪盲肠样品中得到的去杂优化后的细菌16S rRNA基因V4-V5区序列数分别为75,069条和74,759条,平均长度为393.8 bp;按照序列97%相似性进行OTU聚类分析,发现藏猪和瘦肉型猪分别得到660个OTU和668个OTU。两个猪种盲肠中的细菌群落组成相似,其中藏猪盲肠中的细菌分为15个门,70个属,而瘦肉型猪分为15门和74个属,但藏猪盲肠中具有稳定的细菌群落,在不同个体间有256个OTU是共享的,共享的核心菌群占肠道细菌序列总数的88.10%,分为7个门,而瘦肉型猪盲肠中的核心菌群占细菌序列总数的81.29%,分为6个门。Bacteroidetes和Firmicutes均为两个猪种盲肠中最丰富的细菌类群,并且Bacteroidetes的丰度均高于Firmicutes。但与瘦肉型猪相比,藏猪不仅具有高丰度的Bacteroidetes和低丰度的Firmicutes,而且盲肠中有42.4%的细菌属于unclassified和uncultured细菌类群,与肠道疾病紧密相关的Proteobacteria也极显著低于瘦肉型猪(P0.01)。在两个猪种的盲肠中均发现了更多的与降解纤维素有关的细菌如Ruminococcus、Bacteroides、Prevotella、Clostridium、Butyricicoccus、Fibrobacte、Lachnospira、Anaerovibrio、Parabacteroides等。由此可见,藏猪长期食草的特性不仅与肠道微生物群落的稳定性、复杂性及大量不可培养和未分类的微生物有关,还可能与长期采食青粗饲料形成的特殊消化生理有关。3、采用羧甲基纤维素钠平板法和摇瓶发酵法从藏猪盲肠内容物中分离筛选到了一株能够高效降解纤维素的细菌,通过形态学、生理生化特性以及16S rRNA分子学方法将其鉴定为枯草芽孢杆菌,命名为Baclitis sublitis BY-2。Bacillus sublitis BY-2生长快,在接种后8-20 h进入对数期,20-36 h为稳定期,36 h后繁殖逐渐进入衰退期。Bacillus sublitis BY-2所产纤维素酶最适反应条件为pH5.5、65℃,反应5 min,且该纤维素酶具有强的酸碱耐受性和热稳定性。此外,Bacillus sublitis BY-2发酵所需的最佳碳源为1%玉米粉,最佳氮源为2%的蛋白胨+酵母粉复合物(1:1),在发酵起始pH为5.5,接种量4%,发酵至24-36 h时产酶量高且稳定。经过酶学反应和产酶条件的优化,Bacillus sublitis BY-2在发酵至24 h时的酶活(3.43 U/mL)比其原始酶活(0.40 U/mL)提高了近8.6倍。4、从Bacillus subtilis BY-2基因组DNA中克隆到了纤维素酶基因egls-BY,其长度为1500 bp,能够连续编码499个氨基酸。序列分析表明,纤维素酶基因egls-BY所编码的纤维素酶属于糖苷水解酶家族5,并且包含一个CMB-3的结构域,该基因在大肠杆菌中得到了表达,其蛋白分子量在55 kDa左右,表达产物主要以包涵体的形式存在细胞体内。5、体外益生模拟试验表明,Bacillus sublitis BY-2具有强的抗逆特性。在65-85℃的条件下保存20 min,其存活率在89.83-91.07%之间;在pH1-4的人工胃液中培养4 h时,BY-2存活率仍达73.78-83.61%;用人工胃液处理2 h,然后用人工肠液以及不同胆盐浓度的人工肠液中继续处理4 h,Bacillus sublitis BY-2的存活率仍达75%以上。Bacillus sublitis BY-2能够分泌具有抗菌活性的代谢产物,对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,并且对猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02的毒性小;此外,Bacillus sublitis BY-2对ZYM-SIEC02粘附性小,但对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌对猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02的粘附有一定的粘附抑制作用。因此,对于具有生长快,产酶早、产酶能力高且稳定的、且具有强抗逆特性的纤维素分解菌Bacillus subtilis BY-2,不仅对于揭示藏猪食草特性具有重要意义,而且可为产业化开发提供必要的试验依据。
【关键词】：藏猪 细菌群落组成及多样性 纤维素分解菌 纤维素酶 益生菌
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 上篇 文献综述15-36
• 第一章 猪肠道微生物群落与纤维素分解菌的研究进展及意义15-36
• 1.1 引言15-16
• 1.2 猪肠道微生物的组成及变化16-17
• 1.3 影响肠道微生物的因素17-24
• 1.3.1 品种与年龄17-18
• 1.3.2 日粮纤维18-19
• 1.3.3 抗生素19
• 1.3.4 微生态制剂19-22
• 1.3.5 其他物质22-24
• 1.4 分子生物技术在胃肠道微生物研究中的应用24-27
• 1.4.1 16S rRNA基因测序技术24-25
• 1.4.2 变性梯度凝胶电泳技术25-26
• 1.4.3 高通量测序技术26-27
• 1.5 食草动物的食草特性与肠道微生物27-28
• 1.6 纤维素分解菌及纤维素酶的研究进展28-32
• 1.6.1 纤维素分解菌的来源及分离28-29
• 1.6.2 纤维素酶作用机制及其生产29-30
• 1.6.3 影响纤维素酶饲用效果的因素30-31
• 1.6.4 纤维素酶基因的克隆表达及基因工程菌的构建31-32
• 1.7 益生菌的评定及发展趋势32-35
• 1.7.1 益生菌的作用机制及发展32-34
• 1.7.2 益生菌筛选标准及应用34
• 1.7.3 益生菌的发展趋势34-35
• 1.8 研究的目的和意义35
• 1.9 研究的技术路线35-36
• 下篇 试验研究36-116
• 第二章 藏猪胃肠道不同区段细菌群落多样性及组成研究36-55
• 2.1 引言36
• 2.2 材料与方法36-41
• 2.2.1 样品的采集36-37
• 2.2.2 质粒载体与主要试剂37
• 2.2.3 主要仪器设备37-38
• 2.2.4 猪胃肠道微生物总DNA的提取38
• 2.2.5 猪胃肠道细菌 16S rRNA基因V4-V5区序列的扩增38
• 2.2.6 PCR产物的纯化回收38
• 2.2.7 试剂配制38-39
• 2.2.8 变性梯度凝胶电泳39-40
• 2.2.9 DGGE图谱上优势条带的切割回收及克隆测序40-41
• 2.2.10 DGGE图谱分析及序列分析41
• 2.3 结果与分析41-52
• 2.3.1 藏猪胃肠道细菌的多样性42-44
• 2.3.2 藏猪胃肠道细菌群落组成分析44-47
• 2.3.3 藏猪和瘦肉型猪盲肠细菌的多样性的比较分析47-48
• 2.3.4 藏猪和外来猪种瘦肉型猪盲肠细菌群落组成比较分析48-52
• 2.4 讨论52-54
• 2.4.1 细菌 16S rRNA基因可变区的选择52
• 2.4.2 藏猪胃肠道细菌的多样性及群落组成52-53
• 2.4.3 藏猪和瘦肉型猪盲肠细菌的多样性及群落组成比较分析53-54
• 2.5 小结54-55
• 第三章 藏猪和瘦肉型猪盲肠细菌群落多样性及组成研究55-74
• 3.1 引言55
• 3.2 材料和方法55-58
• 3.2.1 样品准备55
• 3.2.2 细菌 16S rRNA V4-V5高变区扩增55-56
• 3.2.4 Miseq文库构建56
• 3.2.5 Miseq测序56
• 3.2.6 测数据优化与统计56
• 3.2.7 测序数据的分析56-58
• 3.2.8 生物统计分析及作图58
• 3.2.9 核酸序列登录58
• 3.3 结果与分析58-71
• 3.3.1 两个猪种盲肠微生物总DNA的提取和细菌 16S rRNA基因V4-V5区扩增58-59
• 3.3.2 藏猪和瘦肉型猪盲肠细菌的丰富度和多样性比较分析59-61
• 3.3.3 藏猪和瘦肉型猪盲肠细菌群落组成的比较分析61-67
• 3.3.4 藏猪和瘦肉型猪盲肠中核心菌群的比较分析67-71
• 3.4 讨论71-73
• 3.4.1 藏猪和瘦肉型猪盲肠中细菌群落的多样性71
• 3.4.2 藏猪和瘦肉型猪盲肠中的核心菌群71-72
• 3.4.4 藏猪盲肠中细菌群落组成与食草特性72-73
• 3.5 小结73-74
• 第四章 藏猪盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定及特性研究74-94
• 4.1 引言74
• 4.2 材料与方法74-81
• 4.2.1 材料74-75
• 4.2.2 方法75-81
• 4.2.3 数据的整理与分析81
• 4.3 结果与分析81-91
• 4.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制81-82
• 4.3.2 纤维素分解菌的分离筛选82-83
• 4.3.3 纤维素分解菌的鉴定83-85
• 4.3.4 纤维素分解菌Bacillus sublitis BY-2 的生长特性85-86
• 4.3.5 CMCase的酶学特性分析86-88
• 4.3.6 发酵条件对Bacillus sublitis BY-2 产CMCase的影响88-91
• 4.4 讨论91-93
• 4.4.1 纤维素分解菌的分离与筛选91
• 4.4.2 纤维素分解菌Bacillus subtilis BY-2 的生长特性91
• 4.4.3 CMCase的酶学特性91-92
• 4.4.4 发酵条件对Bacillus subtilis BY-2 产酶的影响92-93
• 4.5 小结93-94
• 第五章 藏猪源Bacillus subtilis BY-2 纤维素酶基因的克隆表达94-104
• 5.1 引言94
• 5.2 材料与方法94-98
• 5.2.1 材料94-95
• 5.2.2 方法95
• 5.2.3 引物设计95
• 5.2.4 Bacillus sublitis BY-2 纤维素酶基因的克隆及表达95-98
• 5.3 结果与分析98-102
• 5.3.1 Bacillus sublitis BY-2 纤维素酶基因egls-BY的克隆98
• 5.3.2 纤维素酶基因egls-BY的序列分析98-99
• 5.3.3 纤维素酶蛋白结构预测99-100
• 5.3.4 纤维素酶基因egls-BY的原核表达100-101
• 5.3.5 纤维素酶基因egls-BY表达产物的SDS-PAGE分析101-102
• 5.4 讨论102-103
• 5.4.1 纤维素酶基因的克隆102
• 5.4.2 纤维素酶基因egls-BY的表达及SDS-PAGE分析102-103
• 5.5 小结103-104
• 第六章 藏猪源Bacillus sublitis BY-2 的益生特性研究104-116
• 6.1 引言104
• 6.2 材料和方法104-109
• 6.2.1 材料104-105
• 6.2.2 方法105-109
• 6.2.3 数据统计分析109
• 6.3 结果与分析109-112
• 6.3.1 Bacillus subtilis BY-2 的耐热能力109
• 6.3.2 Bacillus subtilis BY-2 耐人工胃液能力109-110
• 6.3.3 Bacillus subtilis BY-2 的耐人工肠液和耐胆盐能力110-111
• 6.3.4 Bacillus sublitis BY-2 的抑菌特性111
• 6.3.5 Bacillus sublitis BY-2 对细胞的毒性和粘附试验111-112
• 6.4 讨论112-115
• 6.4.1 Bacillus sublitis BY-2 的耐热性113
• 6.4.2 Bacillus sublitis BY-2 的耐酸性113
• 6.4.3 Bacillus sublitis BY-2 的耐人工肠液和耐胆盐性113-114
• 6.4.4 Bacillus sublitis BY-2 的抑菌特性114
• 6.4.5 Bacillus sublitis BY-2 对猪小肠上皮细胞的毒性及粘附特性114-115
• 6.5 小结115-116
• 结论116-117
• 创新点117
• 进一步研究的问题117-118
• 参考文献118-135
• 附录135-142
• 缩略词142-143
• 致谢143-144
• 作者简介144

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