通过转录组解析烟粉虱Mediterranean隐种的唾腺、消化道和含菌细胞的生物功能

发布时间：2017-04-17 12:03

  本文关键词：通过转录组解析烟粉虱Mediterranean隐种的唾腺、消化道和含菌细胞的生物功能，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：烟粉虱是一个至少包含36个隐种的物种,其中一些隐种能通过取食植物、传播病毒以及引起植物真菌病害等方式对田间作物造成严重危害。Mediterranean (MED)烟粉虱是起源于地中海区域的烟粉虱隐种,目前已随人类活动而传播到世界多个地方。MED烟粉虱在我国大部分地区均有发生,并在某些区域取代了入侵隐种Middle East-Asia Minor1(MEAM1)成为当地优势种,对农业生产造成严重危害。以往研究表明,MED烟粉虱广泛的寄主适应性和较高的抗药性可能是它们广泛扩散并取代其他隐种的原因。 由于唾腺、消化道和含菌细胞在昆虫取食、营养利用上有着重要的作用,本研究即从昆虫分子生理角度入手,运用转录组的方法研究了重要入侵生物MED烟粉虱这些重要器官的分子特征,试图从分子层面揭示烟粉虱对植物营养利用、应对植物防御反应以及农药抗性的生理生化机制。通过测定烟粉虱唾腺、消化道和含菌细胞这3个与营养生理关系密切的器官转录组,利用分子生物学、生物信息学技术手段对数据进行验证、分析,得出以下研究结果： (1)烟粉虱主唾腺的分子特征与潜在分泌蛋白 通过对烟粉虱主唾腺转录组的测序以及SOAPdenovo拼接,总共获得了13,615个Unigenes,这些基因主要富集于与分泌及合成蛋白的功能相关的途径基因类别中。与虫体相比,在主唾腺中共有565个基因上调,但只有74个具有功能注释,而这注释显示,这些基因主要参与分泌蛋白的加工以及分泌,表明烟粉虱主唾腺是合成唾液成分以及控制唾液分泌的重要器官。 通过生物信息学的方法预测了烟粉虱潜在的唾液蛋白,一共得到了269个潜在分泌蛋白,其中只有28.3%具功能注释。功能注释显示,烟粉虱唾腺中的潜在分泌蛋白参与了植物防御信号的调节以及韧皮部中有害物质的降解或抑制。将烟粉虱唾腺潜在分泌蛋白与蚜虫的分泌蛋白比对,发现只有17个与蚜虫分泌蛋白具有同源性,而且所比对上的蛋白并不包含蚜虫唾液中的效应因子,表明韧皮部取食昆虫唾液蛋白具有种的特异性。 (2)烟粉虱消化道分子特征 通过对烟粉虱消化道转录组的序列拼接,一共获得了27,443个Unigenes。与虫体相比,消化道的Unigenes主要富集于多个生物途径中,其中富集显著性最高的为对外源物质的生物降解和代谢、对辅因子和维生素的代谢以及消化过程。 在烟粉虱消化道转录组中发现了5,771个在消化道特异表达的基因,而这些基因也主要富集于对外源物质的生物降解代谢和消化过程中。对MED和MEAM1消化道基因的同源序列进行氨基酸相似度比较,并进行同义替换和非同义替换值的计算,最后得出解毒相关的途径和酶类都相对保守,但是MED与MEAM1同源基因的氨基酸相似度却比较低,这些酶类和途径可能与这两物种在寄主或环境适应性差异相关。 (3)烟粉虱含菌细胞转录组分析 在烟粉虱含菌细胞中,寄主表达了约5,010个基因,而这些基因所富集的途经主要分为两类,一类与代谢相关,另一类与应激反应相关。与代谢相关的富集途径与共生菌缺失的基因所在的途径呈互补的趋势,可见寄主为共生菌提供它们不能产生的物质。而寄主应激反应转录本的富集则有可能是来自于共生菌的压力。 含菌细胞中表达上调的基因主要和氨基酸代谢转运和应对外界压力这两类生命活动有关,这些基因可能参与给共生菌提供营养物质、良好的栖息环境以及限制共生菌的活动范围。另一方面,寄主也可以通过与共生菌的协作,获取除了组氨酸和精氨酸以外的氨基酸物质,以弥补韧皮部的营养不均衡。 综上所述,唾腺、消化道、含菌细胞在烟粉虱取食、应对植物防御反应以及解决韧皮部营养不平衡的问题中起着关键作用。本研究不仅为进一步揭示入侵烟粉虱—植物互作、烟粉虱—共生菌互作的生理机制提供新的启示和分子数据支撑,也为通过基因调控防控烟粉虱危害提供了重要靶标。
【关键词】：烟粉虱 转录组 唾腺 消化道 含菌细胞
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433.89
【目录】：

• 致谢6-10
• 摘要10-12
• abstract12-19
• 1 文献综述及本研究目的19-33
• 1.1 烟粉虱概述19-21
• 1.1.1 烟粉虱生物特性及分类状况19
• 1.1.2 烟粉虱的为害历史及现状19-20
• 1.1.3 烟粉虱的危害方式20-21
• 1.2 烟粉虱的解剖结构21-23
• 1.2.1 唾腺21-22
• 1.2.2 消化道22-23
• 1.2.3 含菌体23
• 1.3 取食韧皮部汁液昆虫的营养相关器官在昆虫适应性上的作用23-28
• 1.3.1 唾腺23-26
• 1.3.1.1 胶状唾液23-24
• 1.3.1.2 水状唾液24-26
• 1.3.2 消化道26-27
• 1.3.3 含菌体27-28
• 1.4 转录组学在烟粉虱器官功能研究的必要性和可行性28-29
• 1.5 本研究目的与主要内容29-33
• 1.5.1 研究目的29-30
• 1.5.2 研究内容30-33
• 2 基本材料和方法33-43
• 2.1 基本材料33-35
• 2.1.1 供试昆虫及其实验种群维持33
• 2.1.2 主要仪器和设备33-35
• 2.1.2.1 烟粉虱饲养与转移工具33
• 2.1.2.2 烟粉虱解剖和器官收集工具33-34
• 2.1.2.3 分子生物学研究主要仪器设备34
• 2.1.2.4 实验中所使用的相关软件34-35
• 2.2 试验方法35-40
• 2.2.1 烟粉虱DNA提取35
• 2.2.2 鉴定烟粉虱隐种35-36
• 2.2.3 烟粉虱器官或组织的解剖与储存36
• 2.2.4 烟粉虱虫体的总RNA的提取36-37
• 2.2.5 烟粉虱器官或组织的RNA提取37-38
• 2.2.6 cDNA文库的构建及测序38-39
• 2.2.7 RNA反转录cDNA39-40
• 2.2.8 实时荧光定量PCR40
• 2.3 数据处理与分析40-43
• 2.3.1 实时荧光定量PCR数据分析40
• 2.3.2 SOAPdenovo拼接40
• 2.3.3 Trinity拼接40-41
• 2.3.4 对Trinity拼接后的转录本进行聚类41
• 2.3.5 确定序列方向和编码区域41-42
• 2.3.6 转录组数据注释42
• 2.3.7 GO和KEGG富集分析42
• 2.3.8 转录组的非冗余序列表达量的计算42-43
• 3 烟粉虱唾腺的转录组分析43-74
• 3.1 材料与方法43-47
• 3.1.1 试验材料44
• 3.1.2 试验方法44-45
• 3.1.2.1 烟粉虱唾腺细胞核的荧光定位44
• 3.1.2.2 烟粉虱唾腺的解剖收集44
• 3.1.2.3 烟粉虱唾腺与虫体的RNA提取44
• 3.1.2.4 唾腺cDNA文库的构建及测序44
• 3.1.2.5 用于qPCR的唾腺和虫体的cDNA获取44
• 3.1.2.6 参照基因的选取和引物设计44-45
• 3.1.2.7 qPCR的实验流程45
• 3.1.3 数据处理与分析45-47
• 3.1.3.1 唾腺转录组数据的拼接45
• 3.1.3.2 唾腺转录组数据注释45
• 3.1.3.3 基因类别和通路的富集分析45
• 3.1.3.4 唾腺和虫体基因表达量的比较45-46
• 3.1.3.5 估计参照基因的表达稳定性46
• 3.1.3.6 潜在分泌蛋白预测46
• 3.1.3.7 在唾腺转录中找出与蚜虫编码唾液蛋白或潜在唾液蛋白同源的序列46-47
• 3.2 结果47-50
• 3.2.1 烟粉虱唾腺形态特征47
• 3.2.2 烟粉虱主唾腺转录组数据概况47
• 3.2.3 烟粉虱主唾腺转录组注释和分类47
• 3.2.4 烟粉虱主唾腺转录组中富集的途径和基因类别47-48
• 3.2.5 基因在烟粉虱虫体和主唾腺中的表达差异48
• 3.2.6 选择适合的参照基因以及对转录组数据的验证48-49
• 3.2.7 烟粉虱主唾腺中的潜在分泌蛋白49
• 3.2.8 与蚜虫唾液蛋白同源的烟粉虱潜在唾液蛋白49-50
• 3.3 讨论50-74
• 3.3.1 烟粉虱唾液的基因分类及富集类别和通路50-51
• 3.3.2 与虫体相比在烟粉虱主唾腺中差异表达的基因51-53
• 3.3.3 主唾腺的潜在分泌蛋白及其功能推测53-74
• 4 烟粉虱消化道的转录组分析74-98
• 4.1 材料与方法74-76
• 4.1.1 试验材料74
• 4.1.2 试验方法74-75
• 4.1.2.1 烟粉虱消化道的解剖收集74
• 4.1.2.2 烟粉虱消化道RNA提取74-75
• 4.1.2.3 烟粉虱消化道cDNA文库的构建及测序75
• 4.1.3 数据处理与分析75-76
• 4.1.3.1 烟粉虱消化道转录组数据的拼接75
• 4.1.3.2 烟粉虱消化道转录组数据注释75
• 4.1.3.3 烟粉虱消化道转录组基因类别和通路的富集分析75
• 4.1.3.4 消化道中特异表达基因的筛选75
• 4.1.3.5 消化道中特异表达基因富集通路分析75-76
• 4.1.3.6 MED与MEAM1消化道同源基因的筛选76
• 4.1.3.7 MED和MEAM1同源基因对同义替换和非同义替换76
• 4.2 结果76-80
• 4.2.1 烟粉虱消化道转录组数据概况76
• 4.2.2 烟粉虱消化道转录组注释和分类76-77
• 4.2.3 烟粉虱消化道转录组中基因的富集类别和途径77-78
• 4.2.4 与虫体相比在消化道中特异表达的基因的分类78-79
• 4.2.5 MED消化道特异表达蛋白序列与MEAM1消化道相关序列的相似度79
• 4.2.6 MED消化道特异表达基因与MEAM1消化道相关基因的同义替换与非同替换分析79-80
• 4.3 讨论80-98
• 4.3.1 烟粉虱消化道的主要功能80-98
• 4.3.1.1 消化与吸收功能80-81
• 4.3.1.2 烟粉虱消化道的解毒功能81-82
• 4.3.1.3 烟粉虱消化道中特异表达基因在隐种表型差异中的作用82-98
• 5 烟粉虱含菌细胞的转录组分析98-120
• 5.1 材料与方法99-101
• 5.1.1 试验材料99
• 5.1.2 试验方法99
• 5.1.2.1 烟粉虱含菌细胞的解剖收集99
• 5.1.2.2 烟粉虱含菌细胞与虫体的RNA提取99
• 5.1.2.3 烟粉虱含菌细胞cDNA文库的构建及测序99
• 5.1.2.4 用于qPCR的烟粉虱含菌细胞和虫体的cDNA获取99
• 5.1.2.5 验证基因的引物设计99
• 5.1.2.6 qPCR的实验流程99
• 5.1.3 数据处理与分析99-101
• 5.1.3.1 烟粉虱含菌细胞转录组数据的拼接99-100
• 5.1.3.2 烟粉虱含菌细胞转录组数据注释100
• 5.1.3.3 烟粉虱含菌细胞转录组基因类别和通路的富集分析100
• 5.1.3.4 烟粉虱含菌细胞和虫体基因表达量的比较100
• 5.1.3.5 含菌细胞中特异表达基因的筛选100-101
• 5.1.3.6 含菌细胞中高表达和差异表达基因富集通路分析101
• 5.2 结果101-104
• 5.2.1 烟粉虱含菌细胞转录组数据概况101
• 5.2.2 功能注释101-102
• 5.2.3 含菌细胞所表达基因的GO和KEGG富集情况分析102
• 5.2.4 相对于虫体在含菌细胞中上调的基因102-103
• 5.2.5 上调基因的分类103-104
• 5.3 讨论104-120
• 5.3.1 烟粉虱含菌细胞富集途径与寄主—共生菌互作的关系104-105
• 5.3.2 烟粉虱含菌细胞上调基因在寄主—共生菌互作中的作用105-120
• 5.3.2.1 寄主对氨基酸的供给与获取105-107
• 5.3.2.2 含菌细胞中的防御反应107-120
• 6 总讨论120-127
• 6.1 烟粉虱唾腺与食料获取120-121
• 6.2 烟粉虱消化道参与植物营养的过滤与利用121-122
• 6.3 含菌细胞对韧皮部汁液营养不足的补充122-123
• 6.4 本研究的特色与创新之处123
• 6.5 研究中存在的问题123-124
• 6.6 值得继续研究的问题124-127
• 参考文献127-152
• 作者经历15

【参考文献】

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1 Gane Ka-Shu Wong;;KaKs_Calculator:Calculating Ka and Ks Through Model Selection and Model Averaging[J];Genomics Proteomics & Bioinformatics;2006年04期

2 徐文华;左文惠;王瑞明;刘标;金中时;;烟粉虱种群在江苏沿海城市市区的寄主分布与虫源性质[J];华东昆虫学报;2007年03期

3 ;Invasive mechanism and management strategy of Bemisia tabaci(Gennadius) biotype B:Progress report of 973 Program on invasive alien species in China[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2009年01期

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1 徐婧;浙江外来烟粉虱入侵过程及不同生物型烟粉虱生物学特性的比较研究[D];浙江大学;2009年

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本文编号：313154