花鲈繁殖相关基因的克隆及其在雄性个体中的表达调控分析

发布时间：2017-04-17 17:10

  本文关键词：花鲈繁殖相关基因的克隆及其在雄性个体中的表达调控分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本文以山东近海网箱养殖的雄性花鲈(Lateolabrax maculatus)为研究对象,采用组织学、内分泌学和分子生物学等方法,研究花鲈精巢发育特定时期给予激素和盐度处理后其繁殖生理功能的变化规律及分子机制等。研究结果和结论如下：1.花鲈繁殖相关基因的克隆采用RACE技术,利用5’和3’特异引物获得基因全长cDNA序列。克隆得到花鲈繁殖相关的全长基因共12个,分别为(GTHa亚基、FSHβ亚基、LHβ亚基、StAR、 AMH,、FTZ-Fla、FTZ-Flb、CYP171、3β-HSD、vasa、cGnRH-Ⅱ和PRL),以及非全长基因6个(CYP17-Ⅱ、FSHR、PRLR、GR、AR、SOX9)。通过Clustal W进行多序列比对并利用MEGA 5.0软件进行系统进化分析,结果显示所获得的基因在进化上具有高的保守性且都与鲈形目相应物种的亲缘关系最近。2.花鲈繁殖相关基因的周期和空间表达对花鲈繁殖相关基因(GTHs亚基、StAR、AMH、FTZ-F1、CYP171、3β-HSD和AR)在繁殖周期内的表达情况进行分析,发现所检测基因的表达量在繁殖周期内都发生了显著变化,暗示了它们参与了花鲈精巢发育和繁殖过程。对于这些基因的空间表达模式研究发现,它们都在类固醇生成相关组织如精巢、脑、垂体、肝脏、头肾等中表达量高,但在其他组织中也可以检测到基因表达信息。采用原位杂交技术检测精巢内CYP17　I和3β-HSD基因的定位,发现这两个基因都在精巢间质区域检测到阳性信号。同时结合组织学和激素水平的研究,从而对花鲈繁殖相关基因的功能进行更深入的探索。3.雄性花鲈在激素处理后的组织学、睾酮水平及繁殖相关基因表达量的变化给予雄性花鲈注射hCG/GnRHa后,发现精巢生殖细胞发育程度提高,血清中睾酮含量升高。外源激素对脑、垂体和精巢内GTHs亚基基因,精巢中的StAR、FTZ-F1、 CYP171、3β-HSD以及脑中的AR基因的表达具有促进作用,而对于精巢内的AMH和AR基因的mRNA表达有抑制作用。依据这些结果推测外源激素可以促进雄性花鲈精巢细胞的发育,而且所检测的基因都受到促性腺激素和促性腺激素释放激素的调控。4.雄性花鲈在盐度处理后渗透压水平、精巢组织学、激素水平及繁殖相关基因表达量的变化经过半咸水和淡水处理1-8d后,发现花鲈血清渗透压水平显著降低,这与血清中睾酮水平(1-6d)以及精巢组织学变化情况一致。淡水组中,血清FSH和LH浓度降低,而在半咸水组和淡水组盐度适应的前两天,垂体中的GTHα、FSHβ和LHβ亚基的转录水平明显增加。半咸水组和淡水组,尤其是淡水组内的花鲈精巢内3β-HSD、CYP17Ⅰ以及AMH基因mRNA表达量呈现降低的趋势。而半咸水组下4-8d内AR基因mRNA的表达量却逐步升高。这些结果暗示了剧烈的盐度波动可能对花鲈精巢的发育产生抑制作用。
【关键词】：花鲈 精子发生 类固醇生成 hCG和GnRHa激素 盐度
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 前言12-14
• 第1章 文献综述14-25
• 1 花鲈综述14-17
• 1.1.花鲈生物学特征14
• 1.2. 花鲈国内外研究现状14-17
• 2 影响硬骨鱼类繁殖内分泌的内源因子17-19
• 3 硬骨鱼类类固醇生成途径及繁殖相关基因的研究进展19-24
• 4.本研究的目的和意义24-25
• 第2章 花鲈繁殖相关基因的克隆和进化分析25-52
• 1. 材料和方法25-29
• 2. 结果29-48
• 2.1. 花鲈GTHs亚基基因的氨基酸序列以及进化分析29-34
• 2.2. 花鲈StAR基因的氨基酸序列及进化分析34-36
• 2.3. 花鲈AMH基因的氨基酸序列及进化分析36-38
• 2.4. 花鲈FTZ-F1a和FTZ-F1b基因的氨基酸序列及进化分析38-40
• 2.5. 花鲈CYP17Ⅰ基因的氨基酸序列及进化分析40-42
• 2.6. 花鲈3 β-HSD基因的氨基酸序列及进化分析42-45
• 2.7. 花鲈AR基因的氨基酸序列及进化分析45-47
• 2.11 其他基因的获得47-48
• 3 讨论48-52
• 第3章 花鲈繁殖相关基因的周期和空间表达52-69
• 1 材料和方法52-55
• 2 结果55-63
• 2.1 花鲈精巢发育周期的组织学鉴定55-57
• 2.2 花鲈精巢GSI变化57
• 2.3. 花鲈精巢发育周期内睾酮含量的变化57-58
• 2.4. 花鲈繁殖周期内繁殖相关基因的表达量变化58-61
• 2.4.1 花鲈繁殖周期内GTHs亚基基因表达的变化58-59
• 2.4.2 花鲈繁殖周期内StAR、AMH和FTZ-F1基因表达的变化59-60
• 2.4.3 花鲈繁殖周期内CYP17Ⅰ、3β-HSD和AR基因表达的变化60-61
• 2.5 花鲈繁殖相关基因的组织表达模式61-63
• 2.5.1 花鲈GTHs亚基基因的组织表达情况61-62
• 2.5.2 花鲈StAR、AMH和FTZ-F1基因的组织表达情况62
• 2.5.3 花鲈CYP17Ⅰ、3β-HSD和AR基因的组织表达情况62-63
• 3 讨论63-69
• 第4章 雄性花鲈在外源激素处理后的繁殖生理机能变化及分子机制69-86
• 1. 材料和方法69-70
• 2. 结果70-81
• 2.1 雄性花鲈在激素处理后性腺发育情况的变化71-72
• 2.2 雄性花鲈在激素处理后精巢GSI的变化72
• 2.3 雄性花鲈在激素处理后血清中睾酮含量的变化72-73
• 2.4 雄性花鲈在激素处理后脑、垂体以及精巢内GTHs亚基表达量的变化73-77
• 2.4.1 雄性花鲈在激素处理后脑中GTHs亚基表达量的变化73-74
• 2.4.2 雄性花鲈在激素处理后垂体中GTHs亚基表达量的变化74-76
• 2.4.3 雄性花鲈在激素处理后精巢中GTHs亚基表达量的变化76-77
• 2.5 雄性花鲈在激素处理后精巢内StAR，AMH和FTZ-F1基因表达量的变化77-79
• 2.6 雄性花鲈在激素处理后精巢内CYP17Ⅰ,3β-HSD和AR基因表达量的变化79-80
• 2.7 雄性花鲈在激素处理后脑中AR基因表达量的变化80-81
• 3 讨论81-86
• 第5章 雄性花鲈在盐度处理后的繁殖生理功能变化及分子机制86-104
• 1 材料和方法87-88
• 2 结果88-99
• 2.1 雄性花鲈血清渗透压在盐度处理后的变化88-89
• 2.2 雄性花鲈精巢发育状态在盐度处理后的变化89
• 2.3 雄性花鲈血清中激素含量在盐度处理后的变化89-91
• 2.3.1 雄性花鲈血清中T、FSH和LH激素含量在盐度处理后的变化89-91
• 2.3.2 雄性花鲈皮质醇激素含量在盐度处理后的变化91
• 2.4 雄性花鲈垂体中GTHs亚基基因表达量在盐度处理后的变化91-93
• 2.5 雄性花鲈垂体中催乳素基因表达量在盐度处理后的变化93
• 2.6 雄性花鲈精巢中StAR、AMH和FTZ-F1基因表达量在盐度处理后的变化93-95
• 2.7 雄性花鲈精巢中CYP17Ⅰ、3β-HSD和AR基因表达量在盐度处理后的变化95-98
• 2.8 雄性花鲈精巢中GR和PRLR基因表达量在盐度处理后的变化98-99
• 3 讨论99-104
• 第6章 花鲈CYP17Ⅰ和3β-HSD基因在精巢内的定位表达104-116
• 1 材料和方法104-109
• 2 结果109-113
• 2.1. 探针合成过程中的检测结果109-110
• 2.2 斑点检测RNA探针的浓度的结果110-111
• 2.3 原位杂交结果111-113
• 2.3.1 花鲈精巢CYP17Ⅰ基因mRNA的原位杂交结果111-112
• 2.3.2 花鲈精巢3β-HSD基因mRNA的原位杂交结果112-113
• 3 讨论113-116
• 附录116-120
• 中英文缩略词表116-117
• 原位杂交实验中相关试剂的配置117-120
• 参考文献120-147
• 致谢147-148
• 个人简历148

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 胡自民;高天翔;韩志强;宋林;;花鲈和鲈鱼群体的遗传分化研究[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2007年03期

2 楼东,高天翔,张秀梅,杨永恒;花鲈种质资源的研究进展[J];浙江海洋学院学报(自然科学版);2000年02期

3 楼东,张秀梅,柳广东,刘进贤,苑春亭;中日花鲈生化遗传变异的初步研究[J];青岛海洋大学学报(自然科学版);2003年01期

4 刘明月;蒋琦辰;杨家新;;不同海域中国花鲈的细胞色素b序列的遗传分析[J];南京师大学报(自然科学版);2010年01期

5 廖国璋;花鲈的池塘养殖[J];广东科技;1998年11期

6 阮树会,曲永琪,苏纪宏,丁树茂,高天翔,楼东;花鲈稚、幼鱼生长的初步研究[J];海洋湖沼通报;2001年01期

7 李明云,赵明忠,钟爱华,薛良义;山东日照和福建厦门沿海花鲈同工酶的遗传变异分析[J];浙江海洋学院学报(自然科学版);2003年02期

8 陈文忠,赵国翠;花鲈鱼苗淡化及驯化技术的研究[J];科技情报开发与经济;2004年01期

9 刘海燕;张伟;薛敏;吴秀峰;郑银桦;郭利亚;盛洪建;;三聚氰胺对花鲈的急性毒性实验研究[J];水生生物学报;2009年02期

10 洪巧巧;庄平;杨刚;张涛;侯俊利;章龙珍;智玉龙;张航利;杨阳;;长江口中国花鲈食性分析[J];生态学报;2012年13期

中国重要会议论文全文数据库 前6条

1 王兰梅;薛敏;吴秀峰;胡亮;郑银桦;葛红云;邹方起;王赤龙;徐美娜;;饲料中铜和维生素C交互作用对花鲈生长及免疫功能的影响[A];2009年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2009年

2 王兰梅;薛敏;吴秀峰;郑银桦;王嘉;;铜源及不同基础饲料对花鲈生长、铜蓄积量及免疫抗氧化功能的影响[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年

3 唐卫星;殷维;郭立;秦海明;金斌松;吴千红;李博;傅萃长;;西北太平洋近海鱼类中国花鲈呈现空间遗传同质性[A];中国鱼类学会2008学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年

4 刘进贤;高天翔;张亚平;金显仕;唐启升;;花鲈和日本溊群体遗传学研究[A];中国水产学会第七届渔业资源与环境分会2004年度学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年

5 胡亮;薛敏;吴秀峰;郑银桦;王兰梅;葛红云;郭利亚;;发酵豆粕替代鱼粉对花鲈饲生长,氮、磷代谢及肉品质的影响[A];2009年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2009年

6 徐关金;徐善良;王丹丽;;竹醋液对花鲈胚胎及仔鱼存活率的影响[A];2008年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前8条

1 仲雷;花鲈淡水养殖[N];中国渔业报;2007年

2 汪智杰 孙加顺;威海花鲈良种场通过省级验收[N];中国特产报;2001年

3 杰林;花鲈淡水养殖要点[N];湖北科技报;2003年

4 余新;花鲈淡水养殖技术[N];福建科技报;2005年

5 宋锦 杨红玲 颜丙光;花鲈淡化养殖技术[N];中国海洋报;2004年

6 福闻;产学研对接重振鲈鱼产业[N];中国渔业报;2011年

7 杨智;花鲈患淋巴囊肿死亡率高[N];中国渔业报;2013年

8 海玉;花鲈工厂化繁育[N];中国渔业报;2012年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 张艳秋;利用豆粕替代花鲈饲料中鱼粉的潜力及机理[D];浙江大学;2014年

2 迟美丽;花鲈繁殖相关基因的克隆及其在雄性个体中的表达调控分析[D];中国海洋大学;2015年

3 江鑫;花鲈与日本鲈群体遗传结构与多样性研究[D];中国海洋大学;2009年

4 邱丽华;花鲈和军曹鱼部分细胞因子基因的克隆及表达特征研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2005年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 钱q;花鲈类胰岛素生长因子及结合蛋白基因的克隆与表达调控[D];中国海洋大学;2013年

2 吴桂玲;几种免疫增强剂对花鲈非特异性免疫力的影响及免疫疲劳初探[D];中国海洋大学;2007年

3 胡亮;可消化必需氨基酸平衡模式下不同蛋白源替代鱼粉对花鲈生长性能、生理功能及肉品质的影响[D];中国农业科学院;2010年

4 诸葛洋;饲料维生素C对花鲈幼鱼生长和体组成的影响[D];浙江大学;2007年

5 洪巧巧;长江口中国花鲈的食性及分子生物学在食性分析上的应用[D];华东理工大学;2012年

6 袁玉仁;野生和养殖花鲈消化酶活性比较及碱度对花鲈幼鱼消化酶活性的影响[D];中国海洋大学;2011年

7 柴森浩;花鲈仔鱼发育与精液低温冷冻保存研究[D];中国海洋大学;2014年

8 葛红云;饲料中半乳寡糖和棉子糖对花鲈生长、免疫以及肠道菌群的影响[D];中国农业科学院;2010年

9 马志敏;花鲈的代谢能及其主要影响因素[D];中国海洋大学;2004年

10

本文编号：313914