流感病毒mRNA疫苗的构建、制备与实验免疫研究

发布时间：2021-04-25 17:20

　　机体被流感病毒感染后可引起呼吸系统不同程度的损伤。根据世界卫生组织的数据显示,季节性流感病毒（A型H1N1和H3N2流感病毒,以及B型流感病毒）每年在全球范围内造成大约300万至500万例重症病例和29万至65万人死亡。此外,禽流感病毒H5N1和H7N9,已具备了人畜共患特征。随着季节变化和生态改变,常引起跨物种传播,最终导致新型流感病毒株的大流行,造成无数人感染。世界卫生组织每年召开两次流感疫苗组份推荐会（一次针对北半球,另一次针对南半球）,试图根据流行病毒的基因和抗原特征以及各国的流行病学信息来选择正确的疫苗。由于疫苗株是在每个流行季之前6个月左右确定的,偶尔会出现候选疫苗株和流行毒株之间抗原不匹配。因此,需要做好准备应对新型流感病毒。m RNA疫苗可以用作一种应对新发突发传染病的应急疫苗,而且相比传统灭活疫苗和减毒活疫苗等其他类型疫苗具有许多优势。为此,本文主要开展流感病毒m RNA疫苗的制备与实验免疫研究。1. 季节性流感病毒的分离与鉴定由于季节性流感病毒的持续进化,使它们能够逃脱先前感染或接种疫苗引起的免疫。因此,本研究选择在流感病毒流行季节的高峰期2018.12.28～20... 

【文章来源】：军事科学院北京市

【文章页数】：112 页

【学位级别】：博士

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缩略语表
摘要
Abstract
前言
第一章 季节性流感病毒的分离与鉴定
    1.1 材料
        1.1.1 咽拭子样本
        1.1.2 主要试剂
        1.1.3 仪器设备
        1.1.4 SPF级鸡胚
        1.1.5 引物合成
        1.1.6 分子生物学分析软件
    1.2 方法
        1.2.1 咽拭子样本处理
        1.2.2 流感病毒RT-PCR鉴定
        1.2.3 目的基因的纯化与克隆
        1.2.4 SPF级鸡胚接种与尿囊液收取
        1.2.5 鸡血红细胞凝集试验
50)测定">        1.2.6 分离株半数致死量(LD₅₀)测定
    1.3 结果
        1.3.1 咽拭子样本分类
        1.3.2 流感病毒PCR鉴定
        1.3.3 流感病毒的分离
        1.3.4 分离株与同年WHO推荐候选疫苗株HA基因比对分析
50)测定">        1.3.5 分离株A/Jilin/JYT-01/2018（H1N1）半数致死量(LD₅₀)测定
    1.4 讨论
    1.5 小结
第二章 RNA候选疫苗体外转录系统的构建与筛选
    2.1 材料
        2.1.1 细菌、质粒、细胞与流感病毒株
        2.1.2 抗体
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 仪器设备
        2.1.5 溶液配制
        2.1.6 分子生物学分析软件
    2.2 方法
        2.2.1 三种体外转录系统的构建及功能验证
        2.2.2 重组质粒p GEM-EGFP-n1/n2/n3及p GEM-H3N2-HA-n1/n2/n3 构建
        2.2.3 重组质粒大量制备
        2.2.4 重组质粒线性化
        2.2.5 体外转录反应
        2.2.6 mRNA加帽反应
        2.2.7 Cap-m RNA纯化
        2.2.8 Cap-m RNA体外细胞转染试验
        2.2.9 流式细胞术测定EGFP阳性细胞率
        2.2.10 免疫印迹试验（Western Blot）
    2.3 结果
        2.3.1 目的基因EGFP和 H3N2-HA的扩增
        2.3.2 重组质粒p GEM-EGFP-n1/n2/n3及p GEM-H3HA-n1/n2/n3 的线性化处理
        2.3.3 体外转染Cap-m RNA-n1/n2/n3 效果评价
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 mRNA候选疫苗脂质体纳米材料的制备及功能验证
    3.1 材料
        3.1.1 抗体
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 仪器设备
        3.1.4 溶液配制
        3.1.5 实验动物
    3.2 方法
        3.2.1 脂质体纳米颗粒LNP和 LNP-Man的制备
        3.2.2 透射电子显微镜观察
        3.2.3 LNPs/m RNA的制备
        3.2.4 脂质体纳米颗粒粒径及电位测定
        3.2.5 凝胶阻滞试验
        3.2.6 细胞毒性检测
        3.2.7 体外细胞转染效果评价
        3.2.8 体外刺激小鼠树突状细胞成熟
        3.2.9 重组质粒p GEM-Luc-n3 的构建
        3.2.10 动物体内转染效果评价
    3.3 结果
        3.3.1 脂质体纳米颗粒理化性质测定
        3.3.2 LNPs/m RNA体外细胞转染效果评价
        3.3.3 LNPs/m RNA动物体内转染效果评价
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 A型 H1N1、H5N1和B型流感病毒m RNA候选疫苗构建及实验免疫研究
    4.1 材料
        4.1.1 抗体
        4.1.2 毒株
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 仪器设备
    4.2 方法
        4.2.1 A型 H1N1、H5N1及B型流感病毒m RNA候选疫苗的构建策略
        4.2.2 引物设计与合成
        4.2.3 三株流感病毒HA基因扩增及纯化
        4.2.4 三组重组质粒p GEM-HA-n3 构建与鉴定
        4.2.5 三组Cap-m HA-n3 制备
        4.2.6 三组Cap-m HA-n3 功能验证
        4.2.7 三组流感病毒LNPs/m RNA疫苗的制备及免疫策略
50)测定">        4.2.8 A型 H5N1和B型流感病毒株半数致死量(LD₅₀)测定
        4.2.9 血凝抑制效价测定
        4.2.10 血清中总Ig G、Ig G1、Ig G2a抗体水平检测
        4.2.11 血清中IL-4、IFN-γ细胞因子水平检测
        4.2.12 小鼠脾淋巴细胞分离及T细胞亚群鉴定
        4.2.13 小鼠肺组织病理切片制备
        4.2.14 小鼠体重和存活率测定
    4.3 结果
        4.3.1 三组重组质粒p GEM-HA-n3 构建、鉴定及线性化处理
        4.3.2 三组Cap-m HA-n3 制备及功能验证
50)测定">        4.3.3 攻毒株半数致死量(LD₅₀)测定
        4.3.4 血凝抑制效价测定
        4.3.5 血清中总Ig G、Ig G1、Ig G2a抗体水平检测
        4.3.6 血清中IL-4、IFN-γ细胞因子水平检测
        4.3.7 T淋巴细胞亚群检测
        4.3.8 攻毒后小鼠肺组织病理切片观察
        4.3.9 攻毒后小鼠体重和存活率测定
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 结论与展望
参考文献
作者在学期间取得的学术成果
主要简历
致谢



本文编号：3159783