牛奶来源外泌体miRNA和circRNA在金黄色葡萄球菌源乳腺炎中的功能研究

发布时间：2021-04-28 16:11

　　致病菌感染是威胁人类健康的主要原因之一,全球范围内每年因致病菌感染而死亡的人数超过1500万。金黄色葡萄球菌是社区和医院相关感染的主要致病菌,严重威害人类健康并造成巨大经济损失。在农业生产中,由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中最常见的病症之一,不仅会导致奶牛泌乳量下降,还会导致牛奶品质发生变化,进而造成乳制品产业的重大损失。因此,遏制金葡菌感染对于畜牧生产和人类健康具有重要意义。外泌体是一种由细胞分泌的直径约为100nm的囊泡,广泛存在于包括牛奶在内的各种体液中。外泌体中含有大量具有生物功能的内容物（如蛋白、脂质和核酸等）,这些内容物可以通过外泌体的内在化进入受体细胞,从而调控相关生理生化过程。同时,外泌体内容物成分和数量的变化也能够反映出供体细胞的不同生理状况,指示出供体细胞的生理生化变化。但在由致病菌感染引起的相关疾病中,关于外泌体功能的研究尚不明确,尤其是关于外泌体中具有生物学功能的非编码RNA在致病菌感染过程中发挥怎样作用的研究不够深入。因此,本试验以我国西北地区泌乳中期荷斯坦奶牛的牛奶来源外泌体为研究对象,以金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳腺炎为模型,探索致病菌感染... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：221 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章 外泌体非编码RNA在奶牛健康养殖中的功能
        1.1 奶牛健康养殖
        1.2 奶牛乳腺炎
            1.2.1 奶牛乳腺炎的临床表现
            1.2.2 乳腺炎的发病机理
            1.2.3 乳腺炎的危害
            1.2.4 奶牛乳腺炎的检测
            1.2.5 引起奶牛乳腺炎的主要致病菌
        1.3 牛奶来源外泌体
            1.3.1 外泌体概述
            1.3.2 外泌体的生物学起源
            1.3.3 外泌体内容物
            1.3.4 外泌体的分离纯化方法
            1.3.5 外泌体与疾病
            1.3.6 乳汁中外泌体的摄取
        1.4 非编码RNA的生物学特征
            1.4.1 非编码RNA概述
            1.4.2 非编码RNA的分类及功能
            1.4.3 miRNA转录组(miRNAome)概述
            1.4.4 circRNA简述
        1.5 本研究的目的和意义
试验部分
    第二章 牛奶来源金黄色葡萄球菌和外泌体的分离鉴定
        2.1 试验材料
            2.1.1 试验动物
            2.1.2 主要试验试剂
            2.1.3 主要试验仪器
            2.1.4 引物
        2.2 试验方法
            2.2.1 奶牛及乳区的选择
            2.2.2 样品采集
            2.2.3 金黄色葡萄球菌的分离
            2.2.4 金黄色葡萄球菌的生化鉴定
            2.2.5 牛奶来源外泌体的分离
            2.2.6 牛奶来源外泌体的鉴定
        2.3 结果
            2.3.1 奶牛乳腺炎来源葡萄球菌的分离鉴定结果
            2.3.2 牛奶来源外泌体的分离和鉴定
        2.4 讨论
            2.4.1 奶牛乳腺炎致病菌在我国西北地区的分布
            2.4.2 超速离心法提取牛奶来源外泌体
        2.5 小结
    第三章 金黄色葡萄球菌感染诱导牛奶来源外泌体中miRNA的表达量发生变化
        3.1 试验材料
            3.1.1 试验样品
            3.1.2 主要试验试剂
            3.1.3 主要试验仪器
            3.1.4 引物
        3.2 试验方法
            3.2.1 牛奶来源外泌体中总RNA的提取及鉴定
            3.2.2 miRNA文库的构建及高通量测序
            3.2.3 已知的mi RNA的检测与新发现的mi RNA的鉴定
            3.2.4 牛奶外泌体来源miRNA表达差异分析
            3.2.5 牛奶外泌体来源差异表达miRNA的体外检测
            3.2.6 牛奶外泌体来源差异表达miRNA的靶基因预测
        3.3 结果
            3.3.1 牛奶来源外泌体中总RNA的特征分析
            3.3.2 牛奶来源外泌体中miRNA的特征分析
            3.3.3 金黄色葡萄球菌感染和健康牛奶来源外泌体中miRNA的差异表达分析
            3.3.4 表达量有显著差异的已知的miRNA的靶基因预测及功能研究
            3.3.5 奶牛金黄色葡萄球菌感染关键miRNA的筛选
        3.4 讨论
            3.4.1 牛奶来源外泌体中的RNA
            3.4.2 牛奶来源外泌体中miRNA的测序
            3.4.3 牛奶来源外泌体中差异表达的miRNA
        3.5 小结
    第四章 金葡菌感染过程中奶牛关键miRNA靶基因鉴定及功能研究
        4.1 试验材料
            4.1.1 试验样品
            4.1.2 主要试验试剂
            4.1.3 主要实验仪器
            4.1.4 引物
        4.2 试验方法
            4.2.1 关键mi RNA分子bta-mi R-378和bta-mi R-185 靶基因的筛选
            4.2.2 双荧光素酶报告载体psi CHECKTM-2 的构建
            4.2.3 点突变双荧光素酶报告载体的构建
            4.2.4 双荧光素酶报告载体检测bta-mi R-378和bta-mi R-185 靶基因
        4.3 结果
            4.3.1 bta-mi R-378和bta-mi R-185 候选靶基因预测
            4.3.2 bta-mi R-378和bta-mi R-185 候选靶基因的双荧光素酶检测
            4.3.3 点突变双荧光素酶报告载体的构建
            4.3.4 bta-mi R-378和bta-mi R-185 靶基因的双荧光素酶检测
        4.4 讨论
            4.4.1 miRNA的靶基因预测
            4.4.2 奶牛金葡菌感染分子标志物靶基因的功能
        4.5 小结
    第五章 金黄色葡萄球菌感染诱导牛奶来源外泌体中circRNA表达差异分析
        5.1 试验材料
        5.2 试验方法
            5.2.1 circRNA文库的构建及高通量测序
            5.2.2 参考基因组比对分析
            5.2.3 牛奶来源外泌体circRNA外显子、内含子、基因间隔区域分布评估
            5.2.4 牛奶来源外泌体circRNA的预测
            5.2.5 金葡菌感染牛奶来源外泌体circRNA差异表达分析
            5.2.6 金葡菌感染牛奶来源外泌体circRNA功能分析
        5.3 结果
            5.3.1 牛奶来源外泌体中circRNA的特征描述
            5.3.2 金葡菌感染诱导牛奶来源外泌体中circRNA差异表达
        5.4 讨论
        5.5 小结
    第六章 circRNA进入外泌体中的“选择性包装机制”研究
        6.1 试验材料
        6.2 试验方法
            6.2.1 circRNA的验证
            6.2.2 circRNA向外泌体中选择性分泌的研究
        6.3 结果
            6.3.1 circRNA存在于牛奶来源体细胞及外泌体中
            6.3.2 circRNA选择性包装进入外泌体
        6.4 讨论
        6.5 小结
第七章 论文总结
参考文献
附录
缩略词
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]健康养殖——畜牧业未来发展趋势[J]. 朱艳丽.  中国畜牧兽医文摘. 2018(01)
[2]奶牛乳腺炎的诊断与防治[J]. 刘明永.  中国畜牧兽医文摘. 2017(10)
[3]发展水产健康养殖 做好病害防治工作[J]. 黄太寿.  中国水产. 1995(12)



本文编号：3165779