铜诱导斑马鱼视网膜/肠道/血管发育缺陷的分子机理研究
发布时间：2021-05-09 01:25
铜作为一种必需的微量元素,在生物体生长发育中具有着重要的功能,包括参与多种酶的激活、血浆铜蓝蛋白的合成、胶原蛋白的合成等。因此铜在体内稳态的失衡会导致很多疾病和发育缺陷,如贫血、周围神经病等。由于铜(包括Cu20NPs和Cu2+)在生产生活中被广泛应用,由此造成环境中铜污染问题已经十分严重,而铜污染会对鱼类及人类的健康造成不良影响。目前已经有大量的研究评估了铜对水生生物的影响,例如我们的早期研究也发现铜会造成斑马鱼胚胎发育畸形,包括脊柱弯曲变短、眼睛变小、运动功能受损等。然而有关铜造成胚胎发育缺陷相关分子和遗传机制的研究仍然较少。本研究以模式生物斑马鱼为研究对象,通过对刚受精的斑马鱼胚胎进行铜暴露,运用苏木素和伊红染色（hematoxylin-eosin20staining,H&E）、透射电镜（transmission20electron20microscope,TEM）、转录组测序（RNA-seq）、整体原位杂交（whole20mount20in20situ20hybridization,WISH）、荧光定量PCR（RT-PCR）、免疫荧光（immuno...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 铜的研究综述
1.2.1 铜的生物学功能
1.2.2 生物体内铜代谢
1.2.3 铜与疾病的发生
1.3 斑马鱼眼部发育与疾病
1.3.1 斑马鱼眼睛的主要结构
1.3.2 斑马鱼眼睛的早期发育
1.3.3 与视网膜有关的疾病发生
1.4 斑马鱼肠道的发育与疾病
1.4.1 肠的主要结构
1.4.2 斑马鱼肠的早期发育
1.4.3 与肠有关的疾病发生
1.5 斑马鱼血管的发育与疾病
1.5.1 斑马鱼血管发育
1.5.2 血管相关疾病的产生
1.6 内质网应激
1.6.1 内质网应激的产生及调节机制
1.6.2 内质网应激与细胞凋亡
1.6.3 内质网应激与疾病的发生
1.7 活性氧(Reactive oxygen species)与氧化应激
1.7.1 活性氧与氧化应激的产生
1.7.2 氧化应激与细胞凋亡
1.7.3 氧化应激与疾病的发生
1.8 foxm1功能的相关研究
1.9 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验对象
2.1.2 所用载体、菌株和抗体
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 主要实验试剂
2.2 实验方法
2.2.1 铜溶液制备
2.2.2 斑马鱼胚胎铜暴露
2.2.3 浊点萃取
2.2.4 电感耦合等离子质谱(ICP-MS)
2.2.5 透射电子显微镜技术(TEM)
2.2.6 斑马鱼组织冰冻切片
2.2.7 冰冻切片H&E染色
2.2.8 免疫荧光染色
2.2.9 RNA抽提
2.2.10 总cDNA的合成
2.2.11 荧光定量PCR
2.2.12 基因芯片分析表达谱(Microarray)
2.2.13 转录组测序(RNA-seq)
2.2.14 DNA纯化回收
2.2.15 探针质粒的构建
2.2.16 反义mRNA探针的合成
2.2.17 胚胎整体原位杂交
2.2.18 胚胎总蛋白的提取
2.2.19 Western blot分析
2.2.20 细胞凋亡检测(TUNEL)
2.2.21 细胞的培养与传代
2.2.22 细胞的冻存及复苏
2.2.23 细胞铜暴露
2.2.24 细胞迁移与划痕修复实验
2.2.25 胚胎显微注射
2.2.26 统计学分析
3 实验结果
3.1 铜胁迫与斑马鱼胚胎发育
3.1.1 铜胁迫胚胎中铜颗粒和铜离子的定量
3.1.2 铜胁迫下斑马鱼胚胎差异表达基因
3.1.3 纳米铜和铜离子胁迫的斑马鱼胚胎转录表达分析
3.2 铜对斑马鱼胚胎视网膜发育的影响
3.2.1 铜胁迫下斑马鱼胚胎眼的发育情况
3.2.2 铜胁迫下视网膜相关基因的转录水平
3.2.3 铜胁迫下斑马鱼胚胎视锥、视杆细胞蛋白表达水平
3.2.4 铜胁迫下斑马鱼胚胎视网膜细胞凋亡和增殖
3.2.5 铜胁迫斑马鱼胚胎中氧化应激及内质网应激
3.2.6 抗氧化剂和内质网应激拮抗剂可以挽救斑马鱼视网膜的缺陷表型
3.2.7 铜胁迫对cox17~(-/-)突变体斑马鱼视网膜发育的影响
3.2.8 铜胁迫对atp7a~(-/-)突变体斑马鱼视网膜发育的影响
3.3 铜对斑马鱼胚胎肠发育的影响
3.3.1 铜胁迫对斑马鱼胚胎肠结构的影响
3.3.2 铜胁迫下调斑马鱼肠相关基因的表达
3.3.3 铜胁迫斑马鱼胚胎肠细胞中氧化应激和内质网应激
3.3.4 抗氧化剂和内质网应激拮抗剂可以挽救肠的缺陷表型
3.3.5 铜胁迫对cox17~(-/-)突变体斑马鱼肠道发育的影响
3.3.6 铜胁迫对atp7a~(-/-)突变体斑马鱼肠道发育的影响
3.4 铜对斑马鱼血管生成的影响
3.4.1 铜胁迫对斑马鱼胚胎体节间血液循环的影响
3.4.2 铜对斑马鱼胚胎中血管生成相关基因表达的影响
3.4.3 foxm1敲降对斑马鱼胚胎血管的影响
3.4.4 foxm1敲降对斑马鱼胚胎血管生成相关基因表达的影响
3.4.5 铜对HUVECs细胞迁移的影响
4 讨论
4.1 铜胁迫与斑马鱼胚胎发育
4.1.1 铜及纳米铜对生物体具有明显的毒性效应
4.1.2 纳米铜诱导斑马鱼胚胎发育缺陷主要通过其释放的铜离子
4.2 铜胁迫造成斑马鱼视网膜和肠道发育缺陷的分子机理
4.2.1 铜胁迫斑马鱼胚胎视网膜和肠道发育缺陷
4.2.2 铜诱导斑马鱼胚胎产生氧化应激和内质网应激
4.2.3 内质网应激和氧化应激是造成视网膜和肠道缺陷的主要原因
4.2.4 COX17和ATP7A功能缺失部分阻断铜胁迫造成的视网膜和肠畸形
4.3 铜胁迫造成斑马鱼血管发育缺陷的分子机理
4.3.1 铜通过影响血管出芽造成体节间血管缺陷
4.3.2 铜通过下调foxm1诱导斑马鱼体节血管发育缺陷
5 总结
参考文献
附录
致谢
本文编号：3176344
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 铜的研究综述
1.2.1 铜的生物学功能
1.2.2 生物体内铜代谢
1.2.3 铜与疾病的发生
1.3 斑马鱼眼部发育与疾病
1.3.1 斑马鱼眼睛的主要结构
1.3.2 斑马鱼眼睛的早期发育
1.3.3 与视网膜有关的疾病发生
1.4 斑马鱼肠道的发育与疾病
1.4.1 肠的主要结构
1.4.2 斑马鱼肠的早期发育
1.4.3 与肠有关的疾病发生
1.5 斑马鱼血管的发育与疾病
1.5.1 斑马鱼血管发育
1.5.2 血管相关疾病的产生
1.6 内质网应激
1.6.1 内质网应激的产生及调节机制
1.6.2 内质网应激与细胞凋亡
1.6.3 内质网应激与疾病的发生
1.7 活性氧(Reactive oxygen species)与氧化应激
1.7.1 活性氧与氧化应激的产生
1.7.2 氧化应激与细胞凋亡
1.7.3 氧化应激与疾病的发生
1.8 foxm1功能的相关研究
1.9 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验对象
2.1.2 所用载体、菌株和抗体
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 主要实验试剂
2.2 实验方法
2.2.1 铜溶液制备
2.2.2 斑马鱼胚胎铜暴露
2.2.3 浊点萃取
2.2.4 电感耦合等离子质谱(ICP-MS)
2.2.5 透射电子显微镜技术(TEM)
2.2.6 斑马鱼组织冰冻切片
2.2.7 冰冻切片H&E染色
2.2.8 免疫荧光染色
2.2.9 RNA抽提
2.2.10 总cDNA的合成
2.2.11 荧光定量PCR
2.2.12 基因芯片分析表达谱(Microarray)
2.2.13 转录组测序(RNA-seq)
2.2.14 DNA纯化回收
2.2.15 探针质粒的构建
2.2.16 反义mRNA探针的合成
2.2.17 胚胎整体原位杂交
2.2.18 胚胎总蛋白的提取
2.2.19 Western blot分析
2.2.20 细胞凋亡检测(TUNEL)
2.2.21 细胞的培养与传代
2.2.22 细胞的冻存及复苏
2.2.23 细胞铜暴露
2.2.24 细胞迁移与划痕修复实验
2.2.25 胚胎显微注射
2.2.26 统计学分析
3 实验结果
3.1 铜胁迫与斑马鱼胚胎发育
3.1.1 铜胁迫胚胎中铜颗粒和铜离子的定量
3.1.2 铜胁迫下斑马鱼胚胎差异表达基因
3.1.3 纳米铜和铜离子胁迫的斑马鱼胚胎转录表达分析
3.2 铜对斑马鱼胚胎视网膜发育的影响
3.2.1 铜胁迫下斑马鱼胚胎眼的发育情况
3.2.2 铜胁迫下视网膜相关基因的转录水平
3.2.3 铜胁迫下斑马鱼胚胎视锥、视杆细胞蛋白表达水平
3.2.4 铜胁迫下斑马鱼胚胎视网膜细胞凋亡和增殖
3.2.5 铜胁迫斑马鱼胚胎中氧化应激及内质网应激
3.2.6 抗氧化剂和内质网应激拮抗剂可以挽救斑马鱼视网膜的缺陷表型
3.2.7 铜胁迫对cox17~(-/-)突变体斑马鱼视网膜发育的影响
3.2.8 铜胁迫对atp7a~(-/-)突变体斑马鱼视网膜发育的影响
3.3 铜对斑马鱼胚胎肠发育的影响
3.3.1 铜胁迫对斑马鱼胚胎肠结构的影响
3.3.2 铜胁迫下调斑马鱼肠相关基因的表达
3.3.3 铜胁迫斑马鱼胚胎肠细胞中氧化应激和内质网应激
3.3.4 抗氧化剂和内质网应激拮抗剂可以挽救肠的缺陷表型
3.3.5 铜胁迫对cox17~(-/-)突变体斑马鱼肠道发育的影响
3.3.6 铜胁迫对atp7a~(-/-)突变体斑马鱼肠道发育的影响
3.4 铜对斑马鱼血管生成的影响
3.4.1 铜胁迫对斑马鱼胚胎体节间血液循环的影响
3.4.2 铜对斑马鱼胚胎中血管生成相关基因表达的影响
3.4.3 foxm1敲降对斑马鱼胚胎血管的影响
3.4.4 foxm1敲降对斑马鱼胚胎血管生成相关基因表达的影响
3.4.5 铜对HUVECs细胞迁移的影响
4 讨论
4.1 铜胁迫与斑马鱼胚胎发育
4.1.1 铜及纳米铜对生物体具有明显的毒性效应
4.1.2 纳米铜诱导斑马鱼胚胎发育缺陷主要通过其释放的铜离子
4.2 铜胁迫造成斑马鱼视网膜和肠道发育缺陷的分子机理
4.2.1 铜胁迫斑马鱼胚胎视网膜和肠道发育缺陷
4.2.2 铜诱导斑马鱼胚胎产生氧化应激和内质网应激
4.2.3 内质网应激和氧化应激是造成视网膜和肠道缺陷的主要原因
4.2.4 COX17和ATP7A功能缺失部分阻断铜胁迫造成的视网膜和肠畸形
4.3 铜胁迫造成斑马鱼血管发育缺陷的分子机理
4.3.1 铜通过影响血管出芽造成体节间血管缺陷
4.3.2 铜通过下调foxm1诱导斑马鱼体节血管发育缺陷
5 总结
参考文献
附录
致谢
本文编号：3176344
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3176344.html
