茄科物种全基因组抗病基因鉴定及其进化分析

发布时间：2017-04-20 14:20

  本文关键词：茄科物种全基因组抗病基因鉴定及其进化分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着测序技术的快速发展,近年来多个茄科物种的基因组数据相继被释放,这为全基因组范围鉴定抗病基因和物种间比较基因组学的应用提供了平台。植物中大部分(80%)抗病基因属于NBS-LRR类。本研究通过隐马尔科夫模型(Hidden Markov Model,HMM)和BLAST的方法从栽培番茄Heinz1706、野生番茄LA716、栽培马铃薯DM1-3、栽培辣椒Zunla-1、野生辣椒Chiltepin和栽培烟草TN90中分别鉴定出463、485、1,152、1,665、2,042和374个NBS-LRR类抗病基因。相比已报道的结果,本研究从番茄Heinz1706和马铃薯DM1-3中鉴定出69和397个新抗病基因。辣椒基因组内(尤其是野生辣椒Chiltepin)的抗病基因数目在已报道的二倍体物种中是最大的。使用BLSATN的方法(E值为1e-10),我们将本研究从茄科物种鉴定出的绝大多数抗病基因(92%)划分到了87个抗病基因亚家族中,其中16个亚家族为TIR-NBS-LRR(TNL)类,71个为non-TNL(n TNL)类。分析表明,TNL类抗病基因家族的基因结构较n TNL类抗病基因亚家族的基因结构更保守。本研究以番茄基因组的抗病基为对象构建了147个VIGS沉默载体,覆盖番茄Heinz1706中81个抗病基因亚家族的64个,为未来番茄抗病基因的克隆提供了新的途径。虽然茄科物种间抗病基因数目有巨大的差异(如野生辣椒Chiltepin中有2,042个抗病基因而栽培番茄Heinz1706只有463个),但是各个物种内抗病基因亚家族的数目却差不多(如野生辣椒Chiltepin和栽培番茄Heinz1706分别包含83和81个抗病基因亚家族)。进一步分析发现,茄科物种间抗病基因数目的差异主要是由一些大的抗病基因亚家族造成,例如辣椒中22个大的抗病基因亚家族包含全基因组约80%的抗病基因,其中在辣椒Zunla-1和辣椒Chiltepin中最大的5个抗病基因亚家族(Rpi-blb2、BS2、SL-0273、Sw5-c和I2)分别包含832(50.0%)和1,027(50.3%)个抗病基因同源体,而这5个抗病基因亚家族在番茄Heinz1706、番茄LA716和烟草TN90却只含有84(18.1%)、95(19.6%)和73(19.5%)个抗病基因同源体。辣椒中最大的两个抗病基因亚家族(Rpi-blb2和BS2)在辣椒属和茄属内所包含的抗病基因同源体数目相差巨大,例如BS2抗病基因亚家族在两个辣椒基因组内共包含626个同源体,但是在番茄和马铃薯内只包含10个同源体。进一步分析发现这两个抗病基因亚家族的大部分同源体在茄科物种内没有序列交换,表明它们独立进化。抗病基因位点I2/R3在茄科内是个抗病基因聚集的热点,很多抗病基因被定位在此位点,其中包括番茄中的Ty-2、SM,马铃薯中的R3、R6和R7等和辣椒中的L。在本研究中,抗病基因Ty-2定位区间的一侧被定位在标记M-148200(51.63Mb)。该位点内的I2抗病基因亚家族在番茄Heinz1706和马铃薯DM1-3内分别包含36和71条同源体,数目相差近两倍。这两个基因组内的大部分I2同源体都分布在11号染色体长臂近端粒处的几个Mb区域内。根据该位点内的I2同源体的分布,可以进一步将该位点划分成9个亚位点,其中大部分的亚位点在两个基因组内所包含的I2同源体数目不同,而且有的亚位点还存在有和无的多态性。通过序列分析,我们发现番茄中的I2同源体有Type I和Type II两种典型的进化模型,但是马铃薯中的I2同源体却没有Type II类进化模式。对该位点基因结构、复制类型和进化模型的了解可能为以后从该位点克隆抗病基因提供参考帮助。文献报道马铃薯中的R3a(I2同源体)可以被mi R482切割,但是通过生物信息预测和实验验证的方法,我们发现番茄内的I2同源体可以被另一个mi RNAs(mi R6024)切割,并且可以产生21-nt的tasi RNAs。通过分析十个物种内的mi R6024序列,我们推测mi R6024是茄科特有的mi RNA家族。综上所述,本研究通过对茄科物种全基因组范围内抗病基因的鉴定、番茄抗病基因亚家族的划分、抗病基因的进化分析以及抗病基因VIGS沉默载体的构建,为茄科抗性资源的利用以及抗病基因的快速克隆奠定了基础。
【关键词】：茄科 抗病基因 比较基因组学 内含子相位 miRNA
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S641
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略语表12-13
• 第一章 茄科物种全基因组范围抗病基因的分析13-49
• 1.1 前言13-26
• 1.1.1 抗病基因的研究进展13-20
• 1.1.1.1 抗病基因的克隆14
• 1.1.1.2 抗病基因的分类14-17
• 1.1.1.3 抗病基因的数量17-18
• 1.1.1.4 抗病基因的分布18-19
• 1.1.1.5 抗病基因的进化19-20
• 1.1.2 比较基因组学在茄科中的应用20-21
• 1.1.3 茄科抗病基因的研究21
• 1.1.4 病毒诱导的基因沉默（VIGS）21-25
• 1.1.4.1 VIGS技术的作用机理22
• 1.1.4.2 VIGS载体的构建和侵染22-23
• 1.1.4.3 VIGS技术的优缺点23-24
• 1.1.4.4 VIGS技术在植物抗病研究中的应用24-25
• 1.1.5 本研究的目的与意义25-26
• 1.2 材料和方法26-31
• 1.2.1 原始基因组数据及软件26-27
• 1.2.1.1 基因组数据26
• 1.2.1.2 软件及在线工具26-27
• 1.2.2 茄科物种内全基因组范围抗病基因的鉴定27
• 1.2.3 抗病基因的注释和分类27-28
• 1.2.4 抗病基因亚家族的划分及N端保守结构域的预测28-29
• 1.2.5 抗病基因的进化分析29
• 1.2.6 抗病基因的有/无多态性分析29
• 1.2.7 抗病基因综合图谱的构建29-30
• 1.2.8 VIGS载体的构建及侵染流程30-31
• 1.3 结果和分析31-45
• 1.3.1 茄科物种内抗病基因的数目31-32
• 1.3.2 茄科抗病基因亚家族的划分32-33
• 1.3.3 茄科抗病基因亚家族的进化分析33-36
• 1.3.4 两类抗病基因亚家族（TNL和n TNL）内含子特征的多态性36-37
• 1.3.5 茄科物种间抗病基因数目差别的原因37-38
• 1.3.6 抗病基因亚家族（Rpi-blb2和BS2）在茄科中的综合分析38-42
• 1.3.6.1 Rpi-blb2抗病基因亚家族38-40
• 1.3.6.2 BS2抗病基因亚家族40-42
• 1.3.7 茄科抗病基因的综合图42-43
• 1.3.8 番茄中VIGS载体的构建43-45
• 1.4 讨论45-49
• 1.4.1 茄科物种抗病基因的重新鉴定45
• 1.4.2 四个科（茄科、十字花科、葫芦科和禾本科）的大部分抗病基因（>85%）可以被划分到茄科 87 个抗病基因亚家族45-46
• 1.4.3 抗病基因亚家族在四个科内的进化46-47
• 1.4.4 茄科物种间抗病基因数目的差异主要是由几个大的抗病基因亚家族造成的47
• 1.4.5 结论与展望47-49
• 第二章 I2抗病基因位点的进化研究以及I2同源体与mi RNAs的互作49-77
• 2.1 前言49-54
• 2.1.1 番茄黄化曲叶病及抗病基因简介49-50
• 2.1.1.1 番茄黄化曲叶病49-50
• 2.1.1.2 番茄黄化曲叶病抗性基因50
• 2.1.2 I2/R3抗病基因位点的研究进展50-51
• 2.1.3 Mi RNA51-52
• 2.1.3.1 Mi RNA简介51
• 2.1.3.2 Mi RNA基因的典型特征51-52
• 2.1.3.3 22-nt mi RNAs切割靶基因后可诱导产生 21-nt的tasi RNAs52
• 2.1.4 Mi RNAs与抗病基因的互作52-53
• 2.1.5 本研究的目的及意义53-54
• 2.2 材料与方法54-60
• 2.2.1 原始基因组数据及软件54-55
• 2.2.1.1 基因组数据54
• 2.2.1.2 软件及在线工具54-55
• 2.2.3 番茄材料55-56
• 2.2.4 鉴定各基因型对番茄黄化曲叶病的抗性56
• 2.2.5 引物设计和标记开发56
• 2.2.6 I2同源体的获得56-57
• 2.2.6.1 通过PCR技术获得I2同源体56-57
• 2.2.6.2 其他来源的I2同源体57
• 2.2.7 抗病基因Ty-2 和I2同源体的定位57-58
• 2.2.7.1 抗病基因Ty-2 的定位57-58
• 2.2.7.2 定位基因型T和t中的I2同源体58
• 2.2.8 预测并验证与I2同源体互作的mi RNAs58-60
• 2.2.8.1 预测与I2同源体互作的mi RNAs58-59
• 2.2.3.2 实验验证mi RNAs与I2同源体互作59-60
• 2.3 结果与分析60-73
• 2.3.1 抗病基因Ty-2 的定位60
• 2.3.2 I2/R3位点在番茄和马铃薯基因组中的结构60
• 2.3.3 I2/R3位点在番茄和马铃薯中的比较分析60-64
• 2.3.4 不同基因型对TYLCV抗性的检测及基因组内I2同源体的获得64-65
• 2.3.5 红小丽基因型T和t中I2同源体的定位65
• 2.3.6 I2抗病基因亚家族在番茄中的进化模式65-67
• 2.3.7 偶尔发生的组间序列交换有一定的方向性67-68
• 2.3.8 I2抗病基因亚家族在马铃薯中的进化模式68-69
• 2.3.9 鉴定调控I2同源体的mi RNAs69-70
• 2.3.10 Mi R6024切割I2同源体可产生次级s RNAs70-71
• 2.3.11 Mi R6024为茄科特有的mi RNA家族71-73
• 2.4 讨论73-77
• 2.4.1 茄科物种内I2抗病基因位点的多态性73-74
• 2.4.2 抗病基因位点I2在基因型T和LA1777中的结构不同74
• 2.4.3 I2同源体间的序列交换74-75
• 2.4.4 Mi RNAs调控I2同源体的表达75-76
• 2.4.5 结论与展望76-77
• 参考文献77-88
• 附录88-105
• 附表1 第一章的附表88-92
• 附表 1-1 部分物种内抗病基因的数目88
• 附表 1-2 87个抗病基因亚家族在茄科物种内包含的同源体个数88-91
• 附表 1-3 茄属8个非全长BS2同源体在辣椒中的最好匹配序列91-92
• 附表2 第二章的附表92-96
• 附表 2-1 本研究中的通过PCR扩增和NCBI下载的I2同源体92-95
• 附表 2-2 本研究中的引物序列95-96
• 附录1 实验步骤及体系96-101
• 附1.1 基因组DNA小样抽提法96
• 附1.2 PCR体系及程序96-97
• 附1.3 PCR产物回收97
• 附1.4 PCR产物和载体双酶切97-98
• 附1.5 连接98
• 附1.6 TA克隆98
• 附1.7 质粒的抽提98-99
• 附1.8 电击转化农杆菌感受态制备99
• 附1.9 电击转化农杆菌99-100
• 附1.10 VIGS侵染步骤100-101
• 附录2 RNA抽提及 5′RACE步骤101-104
• 附2.1 农杆菌介导的TYLCV侵染101
• 附2.2 Trizol法抽提植物总RNA101
• 附2.3 植物RNA的纯化101-102
• 附2.4 5′RACE步骤102-104
• 附录3 作者简介104-105
• 致谢105-107

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