布鲁菌感染巨噬细胞免疫关键分子的鉴定及其分子机制研究
发布时间：2021-05-20 11:39
布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的人畜共患细菌性传染病,感染后主要引起动物流产和人的波状热。布鲁菌感染宿主细胞后能通过多种方式逃逸宿主的免疫反应,从而在宿主细胞内建立长期持续性的感染。阐明布鲁菌逃逸宿主免疫的机制对于进一步防控布鲁菌病具有重要意义。本研究通过对布鲁菌感染的巨噬细胞不同时间点进行转录组测序,构建了布鲁菌感染巨噬细胞后相关免疫分子动态表达变化,进一步用荧光定量PCR进行验证,鉴定到多个免疫关键分子,选取其中3个重要分子进行研究,从不同宿主分子的角度阐述布鲁菌逃逸免疫的新机制。布鲁菌感染巨噬细胞后期能下调表达TXNIP基因,进一步验证发现布鲁菌感染能够下调表达TXNIP蛋白,其下调表达依赖于活菌以及布鲁菌的IV型分泌系统,在细胞内则通过一氧化氮（NO）来调控TXNIP的表达,而抑制NO的表达后能明显恢复TXNIP的表达。NO的产生也依赖于布鲁菌的IV型分泌系统。说明布鲁菌通过IV型分泌系统影响NO的产生进而调控TXNIP的表达。敲除TXNIP基因后布鲁菌的胞内存活显著提高,进一步研究发现,布鲁菌通过减少活性氧和NO的产生来减弱巨噬细胞的杀伤作用,以利于其胞内存活。布鲁菌感染骨髓来源...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 布鲁菌病原学与致病机制
1.1.1 布鲁菌的病原学
1.1.2 布鲁菌致病机制
1.2 布鲁菌的免疫
1.2.1 布鲁菌感染引起的固有免疫
1.2.2 布鲁菌感染引起的适应性免疫
1.3 布鲁菌逃逸宿主的免疫
1.3.1 布鲁菌干扰固有免疫信号通路
1.3.2 布鲁菌调节适应性免疫
1.3.3 布鲁菌调节细胞的死亡
1.3.4 布鲁菌通过其他方式逃逸宿主免疫
1.4 本研究的目的和意义
第二章 布鲁菌感染巨噬细胞的转录组测序及免疫关键分子鉴定
2.1 材料和方法
2.1.1 菌株,细胞系
2.1.2 相关试剂
2.1.3 相关溶液及试剂配制
2.1.4 主要仪器设备
2.1.5 布鲁菌感染条件的确立及转录组样本的准备
2.1.6 转录组测序结果分析
2.1.7 荧光定量PCR筛选布鲁菌逃逸免疫相关分子
2.1.8 数据统计与分析
2.2 实验结果
2.2.1 布鲁菌感染条件的确定
2.2.2 转录组生物信息学分析结果
2.2.3 筛选布鲁菌逃逸免疫的关键分子
2.3 讨论
第三章 布鲁菌通过下调TXNIP蛋白来增强其胞内存活
3.1 材料和方法
3.1.1 菌株,质粒和细胞系
3.1.2 抗体与相关试剂
3.1.3 相关溶液及试剂配制
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 蛋白免疫印迹检测布鲁菌感染后巨噬细胞后TXNIP的表达变化
3.1.6 通过Crispr敲除TXNIP基因的细胞系
3.1.7 免疫荧光和菌落计数检测布鲁菌胞内存活
3.1.8 荧光定量PCR检测布鲁菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 细胞后相关因子变化
3.1.9 蛋白免疫印迹检测布鲁菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 细胞后相关蛋白表达
3.1.10 流式检测布鲁菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 细胞后活性氧产生
3.1.11 Griess法检测布鲁菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 细胞后一氧化氮产生
3.1.12 通过菌落计数检测原代细胞中TXNIP对布鲁菌胞内存活的影响
3.1.13 通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测小鼠体内TXNIP表达变化
3.1.14 数据统计与分析
3.2 实验结果
3.2.1 布鲁菌感染巨噬细胞后减弱TXNIP的表达,其下调表达依赖于活菌及Ⅳ分泌系统
3.2.2 缺失TXNIP后对布鲁菌的胞内存活的影响
3.2.3 缺失TXNIP对布鲁菌感染后相关蛋白表达和细胞因子的影响
3.2.4 布鲁菌通过减少巨噬细胞一氧化氮的产生来增强其胞内存活
3.2.5 布鲁菌通过减少巨噬细胞ROS的产生来增强其胞内存活
3.2.6 TXNIP的下调表达不依赖于IRE1-miR-17 通路
3.2.7 布鲁菌感染后通过NO来调节TXNIP的表达
3.2.8 iNOS/NO的表达依赖于布鲁菌的Ⅳ分泌系统
3.2.9 TXNIP在原代细胞和小鼠体内的表达
3.3 讨论
第四章 布鲁菌通过上调HO-1蛋白表达来增强其胞内存活
4.1 材料和方法
4.1.1 菌株、质粒和细胞系
4.1.2 抗体与相关试剂
4.1.3 相关溶液及试剂配制
4.1.4 主要仪器设备
4.1.5 蛋白免疫印迹检测布鲁菌感染后巨噬细胞后HO-1 及相关蛋白的表达
4.1.6 通过Crispr敲除HMOX1(HO-1),Nfe2l2(Nrf2)基因的细胞系
4.1.7 菌落计数检测布鲁菌胞内存活
4.1.8 药物抑制HO-1 蛋白活性后检测布鲁菌胞内存活
4.1.9 荧光定量PCR检测布鲁菌感染HO-1~(+/-)RAW264.7 细胞后相关因子变化
4.1.10 蛋白免疫印迹检测抑制或敲除上游相关分子后HO-1 蛋白表达
4.1.11 通过荧光定量PCR,蛋白免疫印迹和ELISA检测原代细胞及小鼠体内HO-1表达变化
4.1.12 数据统计与分析
4.2 实验结果
4.2.1 布鲁菌感染巨噬细胞后增强HO-1 及相关蛋白的表达
4.2.2 布鲁菌通过脂多糖(LPS)来上调表达HO-1 及相关蛋白
4.2.3 布鲁菌通过细胞内AMPK,PI-3K通路来调节HO-1 的表达
4.2.4 缺失或抑制HO-1,Nrf2 蛋白表达后减弱布鲁菌在巨噬细胞的存活
4.2.5 缺失HO-1,Nrf2 后对布鲁菌感染巨噬细胞后活性氧氮产生的影响
4.2.6 布鲁菌在原代细胞上调表达HO-1 以利于其胞内存活
4.2.7 HO-1 在小鼠体内的表达变化
4.3 讨论
第五章 布鲁菌通过上调PRDX5 蛋白表达来增强其胞内存活
5.1 材料和方法
5.1.1 菌株、质粒和细胞系
5.1.2 抗体与相关试剂
5.1.3 相关溶液及试剂配制
5.1.4 主要仪器设备
5.1.5 蛋白免疫印迹检测布鲁菌感染后巨噬细胞后Prdx5 蛋白表达
5.1.6 通过Crispr敲除Prdx5 基因的细胞系
5.1.7 菌落计数检测布鲁菌胞内存活
5.1.8 布鲁菌通过减少巨噬细胞活性氧的产生来增强其胞内存活
5.1.9 布鲁菌通过减少巨噬细胞一氧化氮的产生来增强其胞内存活
5.1.10 通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测小鼠体内Prdx5 表达变化
5.1.11 数据统计与分析
5.2 实验结果
5.2.1 布鲁菌感染巨噬细胞后通过LPS增强Prdx5 蛋白的表达
5.2.2 缺失Prdx5 后对布鲁菌的胞内存活的影响
5.2.3 布鲁菌通过上调Prdx5 减少巨噬细胞活性氧氮的产生
5.2.4 Prdx5 在原代细胞和小鼠体内的表达变化
5.3 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3197689
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 布鲁菌病原学与致病机制
1.1.1 布鲁菌的病原学
1.1.2 布鲁菌致病机制
1.2 布鲁菌的免疫
1.2.1 布鲁菌感染引起的固有免疫
1.2.2 布鲁菌感染引起的适应性免疫
1.3 布鲁菌逃逸宿主的免疫
1.3.1 布鲁菌干扰固有免疫信号通路
1.3.2 布鲁菌调节适应性免疫
1.3.3 布鲁菌调节细胞的死亡
1.3.4 布鲁菌通过其他方式逃逸宿主免疫
1.4 本研究的目的和意义
第二章 布鲁菌感染巨噬细胞的转录组测序及免疫关键分子鉴定
2.1 材料和方法
2.1.1 菌株,细胞系
2.1.2 相关试剂
2.1.3 相关溶液及试剂配制
2.1.4 主要仪器设备
2.1.5 布鲁菌感染条件的确立及转录组样本的准备
2.1.6 转录组测序结果分析
2.1.7 荧光定量PCR筛选布鲁菌逃逸免疫相关分子
2.1.8 数据统计与分析
2.2 实验结果
2.2.1 布鲁菌感染条件的确定
2.2.2 转录组生物信息学分析结果
2.2.3 筛选布鲁菌逃逸免疫的关键分子
2.3 讨论
第三章 布鲁菌通过下调TXNIP蛋白来增强其胞内存活
3.1 材料和方法
3.1.1 菌株,质粒和细胞系
3.1.2 抗体与相关试剂
3.1.3 相关溶液及试剂配制
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 蛋白免疫印迹检测布鲁菌感染后巨噬细胞后TXNIP的表达变化
3.1.6 通过Crispr敲除TXNIP基因的细胞系
3.1.7 免疫荧光和菌落计数检测布鲁菌胞内存活
3.1.8 荧光定量PCR检测布鲁菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 细胞后相关因子变化
3.1.9 蛋白免疫印迹检测布鲁菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 细胞后相关蛋白表达
3.1.10 流式检测布鲁菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 细胞后活性氧产生
3.1.11 Griess法检测布鲁菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 细胞后一氧化氮产生
3.1.12 通过菌落计数检测原代细胞中TXNIP对布鲁菌胞内存活的影响
3.1.13 通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测小鼠体内TXNIP表达变化
3.1.14 数据统计与分析
3.2 实验结果
3.2.1 布鲁菌感染巨噬细胞后减弱TXNIP的表达,其下调表达依赖于活菌及Ⅳ分泌系统
3.2.2 缺失TXNIP后对布鲁菌的胞内存活的影响
3.2.3 缺失TXNIP对布鲁菌感染后相关蛋白表达和细胞因子的影响
3.2.4 布鲁菌通过减少巨噬细胞一氧化氮的产生来增强其胞内存活
3.2.5 布鲁菌通过减少巨噬细胞ROS的产生来增强其胞内存活
3.2.6 TXNIP的下调表达不依赖于IRE1-miR-17 通路
3.2.7 布鲁菌感染后通过NO来调节TXNIP的表达
3.2.8 iNOS/NO的表达依赖于布鲁菌的Ⅳ分泌系统
3.2.9 TXNIP在原代细胞和小鼠体内的表达
3.3 讨论
第四章 布鲁菌通过上调HO-1蛋白表达来增强其胞内存活
4.1 材料和方法
4.1.1 菌株、质粒和细胞系
4.1.2 抗体与相关试剂
4.1.3 相关溶液及试剂配制
4.1.4 主要仪器设备
4.1.5 蛋白免疫印迹检测布鲁菌感染后巨噬细胞后HO-1 及相关蛋白的表达
4.1.6 通过Crispr敲除HMOX1(HO-1),Nfe2l2(Nrf2)基因的细胞系
4.1.7 菌落计数检测布鲁菌胞内存活
4.1.8 药物抑制HO-1 蛋白活性后检测布鲁菌胞内存活
4.1.9 荧光定量PCR检测布鲁菌感染HO-1~(+/-)RAW264.7 细胞后相关因子变化
4.1.10 蛋白免疫印迹检测抑制或敲除上游相关分子后HO-1 蛋白表达
4.1.11 通过荧光定量PCR,蛋白免疫印迹和ELISA检测原代细胞及小鼠体内HO-1表达变化
4.1.12 数据统计与分析
4.2 实验结果
4.2.1 布鲁菌感染巨噬细胞后增强HO-1 及相关蛋白的表达
4.2.2 布鲁菌通过脂多糖(LPS)来上调表达HO-1 及相关蛋白
4.2.3 布鲁菌通过细胞内AMPK,PI-3K通路来调节HO-1 的表达
4.2.4 缺失或抑制HO-1,Nrf2 蛋白表达后减弱布鲁菌在巨噬细胞的存活
4.2.5 缺失HO-1,Nrf2 后对布鲁菌感染巨噬细胞后活性氧氮产生的影响
4.2.6 布鲁菌在原代细胞上调表达HO-1 以利于其胞内存活
4.2.7 HO-1 在小鼠体内的表达变化
4.3 讨论
第五章 布鲁菌通过上调PRDX5 蛋白表达来增强其胞内存活
5.1 材料和方法
5.1.1 菌株、质粒和细胞系
5.1.2 抗体与相关试剂
5.1.3 相关溶液及试剂配制
5.1.4 主要仪器设备
5.1.5 蛋白免疫印迹检测布鲁菌感染后巨噬细胞后Prdx5 蛋白表达
5.1.6 通过Crispr敲除Prdx5 基因的细胞系
5.1.7 菌落计数检测布鲁菌胞内存活
5.1.8 布鲁菌通过减少巨噬细胞活性氧的产生来增强其胞内存活
5.1.9 布鲁菌通过减少巨噬细胞一氧化氮的产生来增强其胞内存活
5.1.10 通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测小鼠体内Prdx5 表达变化
5.1.11 数据统计与分析
5.2 实验结果
5.2.1 布鲁菌感染巨噬细胞后通过LPS增强Prdx5 蛋白的表达
5.2.2 缺失Prdx5 后对布鲁菌的胞内存活的影响
5.2.3 布鲁菌通过上调Prdx5 减少巨噬细胞活性氧氮的产生
5.2.4 Prdx5 在原代细胞和小鼠体内的表达变化
5.3 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3197689
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3197689.html
