外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究
发布时间：2021-05-21 11:06
转基因技术具有推动农业生产发生革命性变化的潜力。农杆菌介导的遗传转化法是目前应用最为广泛的大豆遗传转化方法。但是,与其他的物种相比较,低转化效率一直是大豆基因功能研究中的一个瓶颈,制约了转基因大豆的商业化发展。并且,大豆的遗传转化效率具有很强的基因型依赖性,这限制了遗传转化技术在具有良好性状的商业化大豆品种中的应用。本研究采用不同大豆品种进行农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化和大豆原生质体细胞转化试验,分析了不同大豆品种转化早期阶段外源基因表达差异及其调控机制对大豆抗性丛生芽诱导效率的影响,以期提高大豆的抗性丛生芽再生效率,得到以下主要结果:（1）筛选得到高/低遗传转化效率大豆品种。利用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化体系对17个大豆品种进行遗传转化试验,共获得168株转基因大豆植株。根据不同大豆品种的遗传转化效率,筛选得到大豆品种东农50（DN50）,Williams 82（Wm82）,Bert（Br）和沈农9（SN9）为高遗传转化效率大豆品种（转化效率高于5.5%）,而Kottman（Kt）,General（Gr）,中黄35（ZH35）和辽豆16（LD16）为低遗传转化效率大豆品种（转化...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
第一章 文献综述
1.1 大豆的遗传转化方法
1.2.1 农杆菌介导法
1.2.2 基因枪转化法
1.2.3 聚乙二醇转化法
1.2.4 花粉管通道法
1.2 外源基因表达的影响因素
1.2.1 外源基因插入特性对基因表达的影响
1.2.2 宿主调控对外源基因表达的影响
1.2.3 外界环境条件对外源基因表达的影响
1.3 植物中DNA甲基化
1.3.1 DNA甲基化的产生机制
1.3.2 DNA甲基化的功能
1.3.3 DNA甲基化的研究方法
1.4 原生质体转化与外源基因表达
1.4.1 原生质体转化方法在基因功能研究中的优势
1.4.2 原生质转化方法在基因功能研究中的应用
1.4.3 原生质转化方法的影响因素
1.5 研究的目的与意义
1.6 技术路线
第二章 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化
2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料
2.1.2 试验方法
2.1.3 数据处理与计算
2.2 结果与分析
2.2.1 农杆菌介导的大豆遗传转化
2.2.2 不同大豆品种丛生芽诱导效率
2.2.3 不同大豆品种丛生芽伸长效率
2.2.4 不同大豆品种生根效率
2.2.5 不同大豆品种遗传转化效率
2.3 本章小结
2.3.1 结论
2.3.2 讨论
第三章 大豆原生质体细胞分离和瞬时转化体系
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料
3.1.2 试验方法
3.1.4 数据处理与计算
3.2 结果与分析
3.2.1 大豆原生质体制备和活力检测
3.2.2 组织材料培养时间对原生质体产量及活力的影响
3.2.3 预处理液中甘露醇含量对原生质体产量和活力的影响
3.2.4 酶解液成份对原生质体产量和活力的影响
3.2.5 酶解时间对原生质体产量和活力的影响
3.2.6 不同组织材料类型对原生质体产量和活力的影响
3.2.7 大豆原生质体中外源基因的瞬时表达
3.3 本章小结
3.3.1 结论
3.3.2 讨论
第四章 不同遗传转化效率大豆品种外源基因表达的影响因素研究
4.1 材料与方法
4.1.1 试验材料
4.1.2 试验方法
4.1.3 数据处理与计算
4.2 结果与分析
4.2.1 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的制备
4.2.2 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的转化效率
4.2.3 雌二醇诱导时间对大豆原生质体转化效率的影响
4.2.4 雌二醇浓度对大豆原生质体转化效率的影响
4.2.5 培养时间对不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞外源荧光蛋白表达的影响
4.2.6 不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞内外源基因的表达差异
4.2.7 蛋白酶抑制剂对外源基因表达的影响
4.2.8 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化酶相关编码基因表达水平
4.2.9 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化水平差异
4.2.10 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因表达水平的影响
4.2.11 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因甲基化水平的影响
4.3 本章小结
4.3.1 结论
4.3.2 讨论
第五章 5-AZAC对农杆菌介导的大豆遗传转化的影响
5.1 材料与方法
5.1.1 试验材料
5.1.2 试验方法
5.1.3 数据处理与计算
5.2 结果与分析
5.2.1 不同5-Azac处理浓度对大豆遗传转化的影响
5.2.2 不同5-Azac使用方式对大豆抗性丛生芽诱导效率的影响
5.2.3 5-Azac对不同大豆品种抗性丛生芽诱导效率的影响
5.3 本章小结
5.3.1 结论
5.3.2 讨论
第六章 全文总结
6.1 大豆的遗传转化效率具有显著的基因型差异
6.2 建立高效的大豆原生质体细胞分离和瞬时转化表达体系
6.3 DNA甲基化能够造成大豆品种间外源基因表达水平差异
6.4 甲基化抑制剂5-AZAC能够显著的提高大豆遗传转化过程中抗性丛生芽的诱导效率
6.5 创新点
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]大豆GmAAP基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位[J]. 王俊皓,谢五洋,徐华祥,袁学顺,周莹,崔喜艳. 中国油料作物学报. 2019(05)
[2]提高作物转基因效率方法研究进展[J]. 王臣臣,王丽华,刘言龙,纪康伟,申震,梁坤,詹秋文,李杰勤. 分子植物育种. 2019(11)
[3]A transient expression system in soybean mesophyll protoplasts reveals the formation of cytoplasmic GmCRY1 photobody-like structures[J]. Lu Xiong,Cong Li,Hongyu Li,Xiangguang Lyu,Tao Zhao,Jun Liu,Zecheng Zuo,Bin Liu. Science China（Life Sciences）. 2019(08)
[4]转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因整合分析与品系特异性检测[J]. 金永梅,马瑞,于志晶,林秀峰. 生物技术通报. 2019(03)
[5]一种测定转基因作物中CaMV35S启动子甲基化水平的方法[J]. 黄春蒙,谢家建,杨继彦,彭于发. 农业生物技术学报. 2018(07)
[6]2017年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications;. 中国生物工程杂志. 2018(06)
[7]玉米叶片原生质体的制备及瞬时转化体系的建立[J]. 雷海英,白凤麟,冯宇,郭亚冲,乔楠茜. 长治学院学报. 2018(02)
[8]基因枪法在遗传转化中的研究进展[J]. 王军,付爱根,徐敏,王玉华. 基因组学与应用生物学. 2018(01)
[9]油桐叶肉细胞原生质体分离及瞬时转化体系的建立[J]. 谷战英,杨若楠,陈昊. 林业科学. 2018(01)
[10]半胱氨酸蛋白酶及半胱氨酸蛋白酶抑制剂对逆境胁迫的应答[J]. 张洁琳,付畅. 分子植物育种. 2018(13)
博士论文
[1]植物因子对农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的影响[D]. 贾钰莹.沈阳农业大学 2015
硕士论文
[1]酿酒酵母代谢工程菌利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的研究[D]. 黄一锋.浙江大学 2017
[2]转1Dx5基因致小麦内源1Dx2基因沉默因素的探究[D]. 王翠芳.新疆师范大学 2016
[3]中国大豆主栽品种遗传转化基因型的筛选[D]. 陈普.河北科技师范学院 2015
[4]农杆菌介导大豆子叶节转化体系的优化及大豆耐铝毒候选基因GmSTOP1的克隆与功能分析[D]. 丛亚辉.南京农业大学 2015
[5]小麦条锈菌细胞壁相关基因的寄主诱导转基因沉默研究[D]. 刘强.山东农业大学 2015
[6]农杆菌介导大豆转化体系优化及报告基因DsRed2表达效率评估[D]. 刘旭娇.哈尔滨师范大学 2014
[7]大豆三种不同遗传转化方法的优化研究[D]. 钟影.天津大学 2014
[8]大豆体细胞胚再生体系的优化和遗传转化的初步研究[D]. 程琳静.上海交通大学 2014
[9]烟草核基质结合序列在转基因遗传稳定性中的功能及机理分析[D]. 卢龙涛.山东农业大学 2009
本文编号：3199594
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
第一章 文献综述
1.1 大豆的遗传转化方法
1.2.1 农杆菌介导法
1.2.2 基因枪转化法
1.2.3 聚乙二醇转化法
1.2.4 花粉管通道法
1.2 外源基因表达的影响因素
1.2.1 外源基因插入特性对基因表达的影响
1.2.2 宿主调控对外源基因表达的影响
1.2.3 外界环境条件对外源基因表达的影响
1.3 植物中DNA甲基化
1.3.1 DNA甲基化的产生机制
1.3.2 DNA甲基化的功能
1.3.3 DNA甲基化的研究方法
1.4 原生质体转化与外源基因表达
1.4.1 原生质体转化方法在基因功能研究中的优势
1.4.2 原生质转化方法在基因功能研究中的应用
1.4.3 原生质转化方法的影响因素
1.5 研究的目的与意义
1.6 技术路线
第二章 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化
2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料
2.1.2 试验方法
2.1.3 数据处理与计算
2.2 结果与分析
2.2.1 农杆菌介导的大豆遗传转化
2.2.2 不同大豆品种丛生芽诱导效率
2.2.3 不同大豆品种丛生芽伸长效率
2.2.4 不同大豆品种生根效率
2.2.5 不同大豆品种遗传转化效率
2.3 本章小结
2.3.1 结论
2.3.2 讨论
第三章 大豆原生质体细胞分离和瞬时转化体系
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料
3.1.2 试验方法
3.1.4 数据处理与计算
3.2 结果与分析
3.2.1 大豆原生质体制备和活力检测
3.2.2 组织材料培养时间对原生质体产量及活力的影响
3.2.3 预处理液中甘露醇含量对原生质体产量和活力的影响
3.2.4 酶解液成份对原生质体产量和活力的影响
3.2.5 酶解时间对原生质体产量和活力的影响
3.2.6 不同组织材料类型对原生质体产量和活力的影响
3.2.7 大豆原生质体中外源基因的瞬时表达
3.3 本章小结
3.3.1 结论
3.3.2 讨论
第四章 不同遗传转化效率大豆品种外源基因表达的影响因素研究
4.1 材料与方法
4.1.1 试验材料
4.1.2 试验方法
4.1.3 数据处理与计算
4.2 结果与分析
4.2.1 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的制备
4.2.2 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的转化效率
4.2.3 雌二醇诱导时间对大豆原生质体转化效率的影响
4.2.4 雌二醇浓度对大豆原生质体转化效率的影响
4.2.5 培养时间对不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞外源荧光蛋白表达的影响
4.2.6 不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞内外源基因的表达差异
4.2.7 蛋白酶抑制剂对外源基因表达的影响
4.2.8 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化酶相关编码基因表达水平
4.2.9 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化水平差异
4.2.10 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因表达水平的影响
4.2.11 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因甲基化水平的影响
4.3 本章小结
4.3.1 结论
4.3.2 讨论
第五章 5-AZAC对农杆菌介导的大豆遗传转化的影响
5.1 材料与方法
5.1.1 试验材料
5.1.2 试验方法
5.1.3 数据处理与计算
5.2 结果与分析
5.2.1 不同5-Azac处理浓度对大豆遗传转化的影响
5.2.2 不同5-Azac使用方式对大豆抗性丛生芽诱导效率的影响
5.2.3 5-Azac对不同大豆品种抗性丛生芽诱导效率的影响
5.3 本章小结
5.3.1 结论
5.3.2 讨论
第六章 全文总结
6.1 大豆的遗传转化效率具有显著的基因型差异
6.2 建立高效的大豆原生质体细胞分离和瞬时转化表达体系
6.3 DNA甲基化能够造成大豆品种间外源基因表达水平差异
6.4 甲基化抑制剂5-AZAC能够显著的提高大豆遗传转化过程中抗性丛生芽的诱导效率
6.5 创新点
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]大豆GmAAP基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位[J]. 王俊皓,谢五洋,徐华祥,袁学顺,周莹,崔喜艳. 中国油料作物学报. 2019(05)
[2]提高作物转基因效率方法研究进展[J]. 王臣臣,王丽华,刘言龙,纪康伟,申震,梁坤,詹秋文,李杰勤. 分子植物育种. 2019(11)
[3]A transient expression system in soybean mesophyll protoplasts reveals the formation of cytoplasmic GmCRY1 photobody-like structures[J]. Lu Xiong,Cong Li,Hongyu Li,Xiangguang Lyu,Tao Zhao,Jun Liu,Zecheng Zuo,Bin Liu. Science China（Life Sciences）. 2019(08)
[4]转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因整合分析与品系特异性检测[J]. 金永梅,马瑞,于志晶,林秀峰. 生物技术通报. 2019(03)
[5]一种测定转基因作物中CaMV35S启动子甲基化水平的方法[J]. 黄春蒙,谢家建,杨继彦,彭于发. 农业生物技术学报. 2018(07)
[6]2017年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications;. 中国生物工程杂志. 2018(06)
[7]玉米叶片原生质体的制备及瞬时转化体系的建立[J]. 雷海英,白凤麟,冯宇,郭亚冲,乔楠茜. 长治学院学报. 2018(02)
[8]基因枪法在遗传转化中的研究进展[J]. 王军,付爱根,徐敏,王玉华. 基因组学与应用生物学. 2018(01)
[9]油桐叶肉细胞原生质体分离及瞬时转化体系的建立[J]. 谷战英,杨若楠,陈昊. 林业科学. 2018(01)
[10]半胱氨酸蛋白酶及半胱氨酸蛋白酶抑制剂对逆境胁迫的应答[J]. 张洁琳,付畅. 分子植物育种. 2018(13)
博士论文
[1]植物因子对农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的影响[D]. 贾钰莹.沈阳农业大学 2015
硕士论文
[1]酿酒酵母代谢工程菌利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的研究[D]. 黄一锋.浙江大学 2017
[2]转1Dx5基因致小麦内源1Dx2基因沉默因素的探究[D]. 王翠芳.新疆师范大学 2016
[3]中国大豆主栽品种遗传转化基因型的筛选[D]. 陈普.河北科技师范学院 2015
[4]农杆菌介导大豆子叶节转化体系的优化及大豆耐铝毒候选基因GmSTOP1的克隆与功能分析[D]. 丛亚辉.南京农业大学 2015
[5]小麦条锈菌细胞壁相关基因的寄主诱导转基因沉默研究[D]. 刘强.山东农业大学 2015
[6]农杆菌介导大豆转化体系优化及报告基因DsRed2表达效率评估[D]. 刘旭娇.哈尔滨师范大学 2014
[7]大豆三种不同遗传转化方法的优化研究[D]. 钟影.天津大学 2014
[8]大豆体细胞胚再生体系的优化和遗传转化的初步研究[D]. 程琳静.上海交通大学 2014
[9]烟草核基质结合序列在转基因遗传稳定性中的功能及机理分析[D]. 卢龙涛.山东农业大学 2009
本文编号：3199594
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