两种重要鱼类致病菌感染及减毒活疫苗接种途径的研究

发布时间：2017-04-23 06:09

  本文关键词：两种重要鱼类致病菌感染及减毒活疫苗接种途径的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鳗弧菌是危害我国水产养殖业的重要鱼类致病菌,可由黏膜组织进入鱼体。随着集约化养殖模式兴起,由机械损伤、寄生虫叮咬和肠炎等造成的黏膜损伤时有发生。目前,尚未有关于黏膜损伤对鳗弧菌感染影响的详细报道。本研究首先利用qPCR技术考察了野生型致病性鳗弧菌MVM425浸泡感染斑马鱼后在黏膜组织处的定植情况,该菌可在肠道和皮肤中停留数小时并在皮肤中大量增殖。研究随后建立皮肤和肠黏膜层损伤模型,考察了自然环境下黏膜损伤对鳗弧菌感染的影响。结果显示,MVM425浸泡感染健康、皮肤和肠黏膜层受损斑马鱼的半数致死剂量(LD50)分别为106、103和106CFU/ml。利用免疫组化技术和qPCR技术进一步证实,皮肤黏膜层受损后,鳗弧菌可由皮肤损伤处突破鱼体皮肤屏障,进而迅速增殖并导致内脏出血,引起斑马鱼出现系统性弧菌病症状。因此,养殖过程中避免黏膜损伤尤其是皮肤黏膜层损伤对预防弧菌病十分重要。 接种疫苗是预防弧菌病暴发的有效手段之一。本实验室利用无标记基因缺失技术成功构建鳗弧菌减毒活疫苗MVAV6203,该菌浸泡接种大菱鲆和牙鲆可获得良好免疫保护效果,但对其浸泡接种的进入途径及其能否激发黏膜免疫应答尚不了解。本研究首先利用qPCR技术和透射电镜技术考察了疫苗浸泡接种后在斑马鱼各黏膜组织处的定植情况,疫苗在鳃组织中被迅速清除,在皮肤和肠道中可大量增殖,且在肠道中存留时间较久。电镜结果显示,鳃组织中仅0h时可见极少量疫苗菌体结构,皮肤黏膜层中3h时可见MVAV6203零星分布,而肠道中72h时仍可见MVAV6203样细胞结构存在。对黏膜组织免疫应答相关基因进行考察,各黏膜组织均可依靠TLR5识别MVAV6203鞭毛结构,接种12h时肠道、皮肤和鳃组织中TLR5表达量分别上调4.7倍、7.4倍和3.8倍。此外,肠道中识别脂蛋白和脂多糖的TLR2和TLR4分别于接种24和48h上调表达1.3和1.6倍,并开启MyD88依赖的信号通路,释放IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-a等细胞因子。病理分析证实接种后肠组织产生轻微炎症反应,上皮内淋巴细胞数量自接种后6h显著增加。因此,肠道是MVAV6203进入斑马鱼鱼体及黏膜免疫应答激发的主要场所。 MVAV6203浸泡免疫初期可由斑马鱼黏膜组织进入鱼体并激发黏膜免疫应答,但其激发局部免疫与系统免疫的应答过程及二者联系尚不清楚。本研究利用RT-qPCR技术考察了MVAV6203浸泡接种后激发斑马鱼局部黏膜组织及系统免疫器官的免疫应答过程及效应。免疫初期疫苗可刺激肾脏吞噬细胞增殖并表达TLR5,接种3d时TLR5和吞噬细胞细胞标志物b7r分别上调4.5倍和5.7倍,吞噬细胞随后经血液循环到达黏膜组织处行使识别和吞噬抗原功能,接种21d时皮肤TLR5和b7r表达量分别上调1.9倍和3.3倍。此外,脾脏和肾脏中MHC分子表达量在接种3d时分别上调1.7倍和5.5倍,肠道中MHC分子在接种7d时上调表达1.7倍,免疫接种21d时皮肤中MHC分子及CD4、CD8表达量均上调显著,推测免疫细胞由系统免疫器官迁移至局部黏膜组织行使抗原递呈功能。与Th1、Th2、Thl7和Threg分化相关的细胞因子及转录调控因子分别于接种3d和14～21d在肾脏和皮肤、肠道中上调表达,说明分化成熟的T淋巴细胞先后迁移至系统免疫器官和局部黏膜组织行使细胞介导的免疫应答反应。此外,疫苗接种可快速激活黏膜抗体IgZ介导的体液免疫应答,免疫后期肾脏中IgM大量表达行使系统抗体介导的体液免疫应答功能。因此,疫苗可激发局部免疫与系统免疫,且二者间存在免疫组分迁移现象。 经浸泡和注射接种方式接种MVAV6203的鱼体均可获得良好免疫保护效果,但对两种接种方式激发的免疫应答过程尚不了解。本研究对比分析了疫苗以不同方式接种斑马鱼后激发免疫系统的应答过程。疫苗接种后均可在短时间内激活免疫细胞对抗原的识别和递呈过程,并最终增强免疫系统非特异性及特异性免疫防御能力,但注射方式较浸泡方式可更早产生细胞介导的免疫效应；两种接种方式均可在短时间内激活抗体介导的体液免疫并最终产生系统抗体在黏膜组织处及黏膜抗体在系统免疫器官中介导的免疫效应,仅免疫效应的时相存在差别,证实不同免疫策略可收获相似的效应,为评价疫苗免疫效果奠定理论基础。 除鳗弧菌外,迟钝爱德华氏菌是又一危害我国水产养殖业的鱼类致病菌。实验室前期工作证实,经高浓度迟钝爱德华氏菌菌液浸泡的斑马鱼不易感,但黏膜损伤对该菌感染鱼体的影响尚不清楚。本研究考察了黏膜损伤对迟钝爱德华氏菌EIB202感染斑马鱼的影响。结果显示,EIB202感染皮肤和肠黏膜层受损斑马鱼的LD50分别为107和105CFU/ml,证实肠黏膜受损是斑马鱼感染迟钝爱德华氏菌的“诱导因素”之一,且感染程度与肠黏膜层受损程度有关。对健康及肠黏膜层受损斑马鱼感染EIB202后各组织炎症相关细胞因子进行考察,发现该菌可引起肠黏膜层受损斑马鱼强烈炎症反应,感染72h内多种组织中IL-1β、TNF-α和iNOS表达量显著上调。进一步研究证实,鱼体炎症反应中释放的抗菌物质(如阳离子抗菌肽)可破坏斑马鱼肠固有菌群组成,以利于EIB202在肠道处定植。透射电镜结果显示,未被免疫系统清除的EIB202可在肠道中长期定植。因此,养殖过程通过控制慢性肠炎将有助于迟钝爱德华氏菌病的防控。 综上所述,斑马鱼皮肤和肠黏膜层受损分别是鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌感染鱼体的“诱导因素”之一。肠道是鳗弧菌减毒活疫苗MVAV6203进入斑马鱼体内并激发黏膜免疫应答的主要场所,疫苗可激发局部免疫与系统免疫且二者间存在免疫组分迁移现象。疫苗注射和浸泡接种方式激发免疫应答过程不同,但均可激发抗体和细胞介导的体液和细胞免疫。
【关键词】：鳗弧菌 迟钝爱德华氏菌 减毒活疫苗 斑马鱼 感染途径 黏膜免疫应答 系统免疫 局部免疫
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 文献综述14-34
• 1.1 水产养殖病害及疫苗14-18
• 1.1.1 鳗弧菌及弧菌病14-16
• 1.1.2 迟钝爱德华氏菌及迟钝爱德华氏菌病16-17
• 1.1.3 水产疫苗种类及递送17-18
• 1.2 水产病害的感染途径18-23
• 1.2.1 鱼类黏膜组织结构18-21
• 1.2.2 鳗弧菌感染鱼体进入途径的研究进展21-23
• 1.2.3 研究病原进入途径的方法及意义23
• 1.3 鱼类黏膜组织的先天免疫系统23-26
• 1.3.1 黏液23-24
• 1.3.2 体液免疫24-25
• 1.3.3 细胞免疫25-26
• 1.4 鱼类黏膜组织的适应性免疫系统26-27
• 1.4.1 体液免疫26
• 1.4.2 细胞免疫26-27
• 1.5 鱼类免疫应答过程27-32
• 1.5.1 抗原识别27-29
• 1.5.2 炎症反应29-31
• 1.5.3 抗原加工及递呈31
• 1.5.4 淋巴细胞活化31-32
• 1.5.5 黏膜免疫应答与系统免疫应答32
• 1.6 论文的主要内容及意义32-34
• 第2章 黏膜损伤对鳗弧菌感染斑马鱼的影响34-55
• 2.1 引言34
• 2.2 实验材料34-35
• 2.2.1 菌株及实验动物34
• 2.2.2 药品及仪器34-35
• 2.2.3 培养基及溶液配制35
• 2.3 实验方法35-42
• 2.3.1 实验动物驯养35-36
• 2.3.2 菌体培养及制备36
• 2.3.3 细菌质粒抽提36-37
• 2.3.4 鳗弧菌感受态制备37
• 2.3.5 电转37
• 2.3.6 鳗弧菌复壮37-38
• 2.3.7 定量检测病原菌方法的建立38-39
• 2.3.8 斑马鱼黏膜组织损伤模型建立39
• 2.3.9 病原菌感染方式39
• 2.3.10 斑马鱼组织取样39-40
• 2.3.11 细菌及动物组织基因组抽提40-41
• 2.3.12 免疫组织化学检测41
• 2.3.13 黏液抑菌实验41-42
• 2.4 实验结果42-51
• 2.4.1 鳗弧菌毒株的复壮42
• 2.4.2 qPCR法定量检测鳗弧菌模型建立42-43
• 2.4.3 不同接种方式鳗弧菌感染斑马鱼毒力考察43-44
• 2.4.4 鳗弧菌感染斑马鱼进入途径考察44-46
• 2.4.5 鳗弧菌感染皮肤、肠黏膜层受损斑马鱼毒力考察46-48
• 2.4.6 鳗弧菌在健康和皮肤黏膜层损伤斑马鱼组织中的定植考察48-49
• 2.4.7 鳗弧菌感染皮肤损伤修复中的斑马鱼毒力考察49-51
• 2.4.8 斑马鱼皮肤黏液对鳗弧菌生长的抑制作用51
• 2.5 实验讨论51-54
• 2.6 本章小结54-55
• 第3章 鳗弧菌减毒活疫苗浸泡免疫斑马鱼的黏膜免疫应答55-74
• 3.1 引言55
• 3.2 实验材料55-56
• 3.2.1 菌株及实验动物55
• 3.2.2 药品及仪器55
• 3.2.3 培养基及溶液配制55-56
• 3.3 实验方法56-59
• 3.3.1 斑马鱼浸泡免疫56
• 3.3.2 斑马鱼组织RNA抽提56-57
• 3.3.3 RNA消化、逆转录57
• 3.3.4 RT-qPCR57-58
• 3.3.5 病理组织样品制备及分析58-59
• 3.3.6 透射电镜样品制备及分析59
• 3.4 实验结果59-67
• 3.4.1 鳗弧菌减毒活疫苗浸泡接种斑马鱼进入途径考察59-60
• 3.4.2 鳗弧菌减毒活疫苗在黏膜组织中的存留60-62
• 3.4.3 斑马鱼黏膜组织对鳗弧菌减毒活疫苗的识别62
• 3.4.4 斑马鱼黏膜组织对鳗弧菌减毒活疫苗的摄取62
• 3.4.5 浸泡接种后斑马鱼黏膜组织细胞因子的分泌表达62-67
• 3.4.6 浸泡接种后斑马鱼肠黏膜组织的炎症反应67
• 3.5 实验讨论67-71
• 3.6 本章小结71-74
• 第4章 鳗弧菌减毒活疫苗免疫斑马鱼激发的系统免疫与局部免疫74-83
• 4.1 引言74
• 4.2 实验材料与方法74
• 4.3 实验结果74-77
• 4.3.1 局部炥膜组织与系统免疫器官对减毒活疫苗的识别和摄取74
• 4.3.2 局部黏膜组织与系统免疫器官对减毒活疫苗的加工和递呈74-75
• 4.3.3 局部黏膜组织与系统免疫器官浸泡接种后T细胞的增殖和分化75-76
• 4.3.4 局部黏膜组织与系统免疫器官浸泡接种后抗体分泌76-77
• 4.4 实验讨论77-82
• 4.5 本章小结82-83
• 第5章 鳗弧菌减毒活疫苗不同接种方式激发的免疫应答83-94
• 5.1 引言83
• 5.2 实验材料与方法83
• 5.3 实验结果83-87
• 5.3.1 不同方式接种激发的免疫系统对减毒活疫苗的识别和摄取83-85
• 5.3.2 不同方式接种激发的免疫系统对减毒活疫苗的加工85
• 5.3.3 不同方式接种激发的免疫系统对减毒活疫苗的递呈85-87
• 5.3.4 不同方式接种激发的抗体分泌87
• 5.4 实验讨论87-92
• 5.5 本章小结92-94
• 第6章 黏膜损伤对迟钝爱德华氏菌感染斑马鱼的影响94-104
• 6.1 引言94
• 6.2 实验材料94
• 6.3 实验方法94-95
• 6.3.1 菌体培养及制备94-95
• 6.3.2 病原菌接种方式95
• 6.4 实验结果95-99
• 6.4.1 不同接种方式迟钝爱德华氏菌感染斑马鱼毒力考察95-97
• 6.4.2 感染迟钝爱德华氏菌后斑马鱼各组织炎症相关细胞因子的表达97
• 6.4.3 感染迟钝爱德华氏菌后斑马鱼各组织抗菌反应相关细胞因子的表达97
• 6.4.4 迟钝爱德华氏菌在肠黏膜损伤斑马鱼肠道中的存留97-99
• 6.5 实验讨论99-102
• 6.6 本章小结102-104
• 第7章 主要结论和创新点104-107
• 7.1 主要结论104-105
• 7.2 创新点105
• 7.3 展望105-107
• 参考文献107-122
• 攻读博士学位期间撰写的论文122-123
• 致谢123

【共引文献】

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