紫花苜蓿响应低温的差异蛋白质组学研究

发布时间：2017-04-24 15:19

  本文关键词：紫花苜蓿响应低温的差异蛋白质组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：紫花苜蓿(Medicago sative L.)是重要的多年生饲用牧草,因其营养丰富,适口性好,产草量高,抗逆性强,而被誉为“牧草之王”,是北方地区主栽的牧草品种之一。但北方(尤其是黑龙江)的低温环境一直以来都是制约苜蓿产量、质量以及品种多样性的因素之一,对紫花苜蓿低温应答机制的研究具有一定的理论意义和实际价值。本研究通过田间试种试验选择了两种抗寒差异较大的紫花苜蓿肇东和WL525HQ作为试验材料,对其低温胁迫下的各项生理指标进行了测定;优化紫花苜蓿叶片低丰度蛋白的提取方法;通过双向电泳与质谱联用技术对两种苜蓿响应低温的差异蛋白质组进行了研究,并利用RT-PCR技术对差异蛋白进行验证,以期从生理和蛋白质角度阐述紫花苜蓿应对低温胁迫的适应机制。研究结果如下:1.对供试材料进行了田间试种试验,调查结果显示肇东苜蓿、WL323HQ、三得利、维多利亚和WL525HQ的生育期和各项农艺学性状之间没有明显差异;但刈割后的植株再生高度和第二年返青率差异明显。五种苜蓿的抗寒能力表现为肇东苜蓿WL323HQ三得利≥维多利亚WL525HQ。其中,肇东苜蓿和WL525HQ间的抗寒能力差异最大,可作为后续试验的材料。2.对低温胁迫下紫花苜蓿的各项生理生化指标测定结果显示,紫花苜蓿的叶绿素含量降低,WL525HQ叶绿素降低比例高于肇东苜蓿。抗氧化酶POD、APX、GR、DHAR、MDHAR和GSH-PX活性呈上升趋势,SOD活性先升高后降低;除APX外,其余酶在肇东苜蓿中活性增加更多,表现出与抗寒能力的正相关。低温胁迫下,紫花苜蓿叶片的相对电导率升高,WL525HQ的电导率增长高于肇东苜蓿;叶片可溶性糖含量升高,肇东苜蓿糖的积累高于WL525HQ。游离氨基酸测定结果显示,14种常见的游离氨基酸存在于紫花苜蓿叶片中(未检测到蛋氨酸和甘氨酸);低温胁迫下,肇东苜蓿中14种游离氨基酸含量均发生一定变化,WL525HQ中则有11种游离氨基酸含量发生变化(丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸不变);两种苜蓿中游离氨基酸变化表现品种间的差异性;其中,肇东苜蓿游离脯氨酸的含量明显高于WL525HQ,表现出与其抗寒能力的正相关。3.为了提高低丰度蛋白的分辨率,本研究通过Mg/NP-40与0、15%、17.5%、20%终浓度的PEG分别对紫花苜蓿叶片蛋白进行了分级提取,并筛选适合紫花苜蓿叶片低丰度蛋白提取的PEG浓度。结果表明,终浓度为17.5%的PEG能够有效去除大部分高丰度蛋白RuBisCO,提高差异蛋白质点的检测率,最适合紫花苜蓿叶片低丰度蛋白的提取,以此建立了紫花叶片低丰度蛋白的提取方法。4.对紫花苜蓿叶片的全蛋白和低丰度蛋白进行了分别提取,通过双向凝胶电泳和质谱联用技术对两种苜蓿响应低温的差异蛋白质组进行了研究。低温胁迫下,在两种紫花苜蓿中共鉴定出表达量发生1.5倍以上改变的差异蛋白点67个。通过生物信息学分析,根据蛋白质的功能将其进行分类:与光合作用相关蛋白占42%,与能量代谢相关蛋白占18%,与响应胁迫和氧化还原相关蛋白占13%,与生物合成相关蛋白占13%,与蛋白质加工相关蛋白占9%,未知功能蛋白占5%。5.低温胁迫下,肇东苜蓿中有49个蛋白质的表达量发生改变,其中15个蛋白质也参与WL525HQ的低温应答,但变化的方式与肇东苜蓿并不相同;其余34个蛋白质仅在肇东苜蓿中响应低温胁迫,在WL525HQ中蛋白表达量并不发生变化。低温胁迫初期(12 h),肇东苜蓿中有47个蛋白质表达量变化在1.5倍以上;胁迫7 d时,20个蛋白质表达量改变,一半以上的蛋白质表达趋于稳定,不再变化。6.低温胁迫下,WL525HQ中有24个蛋白质的表达量发生改变,其中9个蛋白质表达量仅在WL525HQ中发生改变。另有9个点在WL525HQ并不随温度变化而改变,但始终保持较高的表达量。低温胁迫初期(12 h)有20个蛋白质表达量变化在1.5倍以上;胁迫7 d时,22个蛋白质表达量改变。7.对参与光合作用、能量代谢、响应胁迫及氧化还原、生物合成、蛋白质加工和未知功能蛋白的6个差异蛋白在mRNA水平进行验证,肇东苜蓿和WL525HQ中,转录水平与蛋白质水平表达趋势一致的蛋白占验证蛋白总数的50%和66.7%。肇东苜蓿中,RuBisCO大亚基、乌头酸水合酶、真核翻译起始位点的蛋白水平表达量变化与其基因水平呈高度线性相关;WL525HQ中,RuBisCO大亚基、单脱氢抗坏血酸还原酶、肉桂酰辅酶A转移酶、真核翻译起始因子的蛋白表达量变化与基因水平呈高度线性相关。
【关键词】：紫花苜蓿 低温胁迫 RuBisCO 蛋白质组
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S541.9
【目录】：

• 摘要11-13
• Abstract13-16
• 第1章 绪论16-36
• 1.1 紫花苜蓿抗寒性研究进展16-22
• 1.1.1 植物响应低温的生理机制16-19
• 1.1.2 紫花苜蓿的抗寒性研究19-22
• 1.2 植物蛋白质组学研究22-34
• 1.2.1 蛋白质组学的产生22-23
• 1.2.2 植物蛋白质组学的研究技术23-25
• 1.2.3 植物响应低温蛋白质组学研究进展25-32
• 1.2.4 紫花苜蓿蛋白质组学研究进展32-34
• 1.3 本研究的目的意义和技术路线34-36
• 第2章 紫花苜蓿响应低温的生理生化研究36-54
• 2.1 试验材料与方法36-42
• 2.1.1 试验地概况36
• 2.1.2 供试材料36
• 2.1.3 试验试剂与仪器36-37
• 2.1.4 试验方法37-42
• 2.2 结果与分析42-53
• 2.2.1 紫花苜蓿农艺学性状42-43
• 2.2.2 低温胁迫对紫花苜蓿叶绿素含量的影响43-44
• 2.2.3 低温胁迫对紫花苜蓿各种抗氧化酶活性的影响44-47
• 2.2.4 低温胁迫对紫花苜蓿细胞膜透性的影响47-48
• 2.2.5 低温胁迫对紫花苜蓿可溶性糖含量的影响48-49
• 2.2.6 低温胁迫对紫花苜蓿游离氨基酸含量的影响49-53
• 2.3 本章小结53-54
• 第3章 紫花苜蓿响应低温的差异蛋白质组学研究54-104
• 3.1 试验材料与方法54-62
• 3.1.1 供试材料54
• 3.1.2 试验试剂与仪器54-55
• 3.1.3 试验方法55-62
• 3.2 结果与分析62-103
• 3.2.1 紫花苜蓿低丰度蛋白优化结果62-66
• 3.2.2 紫花苜蓿响应低温的差异蛋白质组学分析66-95
• 3.2.3 差异蛋白的RT-PCR分析95-103
• 3.3 本章小结103-104
• 第4章 讨论104-118
• 4.1 供试品种的选择104
• 4.2 PEG法提取紫花苜蓿叶片低丰度蛋白104-105
• 4.3 紫花苜蓿对低温的响应机制105-114
• 4.3.1 紫花苜蓿光合作用系统对低温的响应105-108
• 4.3.2 紫花苜蓿减缓能量代谢响应低温胁迫108-110
• 4.3.3 紫花苜蓿抗氧化还原系统对低温的响应110-112
• 4.3.4 紫花苜蓿生物合成相关蛋白对低温的响应112-113
• 4.3.5 紫花苜蓿蛋白质加工相关蛋白对低温的响应113-114
• 4.4 两种紫花苜蓿的抗寒差异性分析114-116
• 4.4.1 肇东苜蓿对低温胁迫的响应114-115
• 4.4.2 WL525HQ对低温胁迫的响应115-116
• 4.5 差异蛋白表达量验证116
• 4.6 本研究的创新点及展望116-118
• 结论118-119
• 参考文献119-134
• 附录134-137
• 攻读博士期间发表的论文137-139
• 致谢139

【参考文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 邓纲;苎麻响应N、P、K亏缺差异蛋白质组学研究[D];华中农业大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 刘啸然;苗期低氮处理对水培黄瓜生长及AsA代谢相关酶活性的影响[D];中国农业科学院;2011年

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本文编号：324477