瓜类细菌性果斑病菌单克隆抗体的制备及免疫层析快速检测方法的建立

发布时间：2021-06-30 23:06

　　瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli,Ac）是一种种传病菌,可感染西瓜、甜瓜、哈密瓜、南瓜、黄瓜、丝瓜等多种葫芦科植物,导致减产甚至绝收。该病菌的抗逆能力非常强,可在种子表面存活35年,并通过带菌种子实现远距离传播。Ac可侵染果实、植株及种子,具有发病迅速、爆发性强、传播快等特点,一旦感染会对瓜类产量带来巨大经济损失,该病害是影响我国瓜类生产的主要病害之一。目前,检测果斑病菌常用的方法为基于PCR的方法,该方法检测灵敏度相对较高,但需要精密的热循环仪,且需要3⁴ h才能获得比较准确的结果。此方法需要在一个装备齐全的实验室中进行,不适用于病原菌的田间快速检测。免疫学检测方法,如酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）需要较长的孵育时间,不适用于田间快速检测。而免疫学快速检测方法,如免疫层析试纸条,其操作简便、检测时间短,不需要使用仪器,在田间病原菌的快速筛查上具有良好的应用前景。为建立检测果斑病菌的免疫学快速检测方法,本课题首先制备了抗瓜类细菌性果斑病菌SD01的单克隆抗体,结果显示:... 

【文章来源】：上海理工大学上海市

【文章页数】：120 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

基于抗原标记的荧光免疫试纸条的原理图

在优化FITC浓度时,改良培养基中FITC的最高浓度为400μg/mL,需要对菌株的生长状态进行评估。将过夜活化的SD01菌株,按照1:100的比例转接到新鲜的脑心浸液培养基及添加FITC浓度为400μg/mL的改良培养基中,每间隔1h取200μL菌悬液加到酶标板中,测定600 nm波长处的OD值,并绘制生长曲线,结果如图5-2所示。由图可以看出,在改良的培养基中,菌株SD01的生长未受到明显的抑制,在培养13 h后,与正常培养基中培养的SD01菌株,OD值均可以达到1.0左右,即菌液浓度均可以达到4.5×109CFU/mL。5.3.2 最佳FITC浓度的优化

随后,选取另一系列FITC浓度(10μg/mL,15μg/mL,20μg/mL,25μg/mL,30μg/mL,35μg/mL,40μg/mL)添加到脑心浸液培养基中,对果斑病菌SD01培养。如图5-3B所示,流式细胞仪测定不同FITC浓度下细菌的荧光强度,比较各组间M3区域的比例发现,当FITC浓度为20μg/mL时,细菌分布在M3区域的比例最高,因而20μg/mL作为单次实验结果中细菌培养时最佳FITC浓度。重复三次测定细菌荧光强度的结果如图5-4所示,菌株SD01在不同FITC浓度的改良培养基中的总荧光标记率(M2+M3+M4)如图5-4A所示,由图可以看出,在FITC浓度低于200μg/mL时,细菌总荧光标记率可达到95%以上;分布在M3区域荧光细菌的比例如图5-4B所示,当FITC浓度为20μg/mL时,M3区域的荧光细菌的比例显著高于15μg/mL,因而最佳的改良培养基中FITC浓度为20μg/mL。


本文编号：3258664