7种植物内生和根际放线菌的分离鉴定及抗菌活性研究

发布时间：2017-04-25 10:13

  本文关键词：7种植物内生和根际放线菌的分离鉴定及抗菌活性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：放线菌是微生物天然产物的重要来源,已知约有22000种生物活性化合物来源于微生物,而其中45%是由放线菌产生的。但是随着常规分离技术的不断应用,筛选得到新型抗生素的几率不断降低,而由于选择性分离和遗传学技术的发展,从稀有放线菌中得到的抗生素数量逐年增加。在此背景下,鉴定那些尚未开发其合成天然产物潜力的生物资源可以提高发现新型菌株的可能性,而稀有放线菌的分离筛选,可能是现代药物发现项目成功的关键。为了充分了解环境中微生物的多样性,必须使用适当的分离技术。本研究选取了枸杞、地黄、白茅、紫花地丁、柴胡、凬草、黄连7种植物,利用选择性分离方法,对其根及根际土壤进行放线菌多样性及活性化合物初步研究。(1)本研究对7种植物的根进行干热处理,对其根际土壤进行离心富集,并选用抗菌药物进行放线菌的选择性分离。从7种植物的根和根际土壤总共分离得到192株放线菌,形态学上大多属于链霉菌属和小单孢菌属,其中类链霉菌约占分离菌株的60-70%,属优势菌群;其中植物内生菌70株,根际放线菌122株,除枸杞和白茅样品外,其它植物的根际放线菌均多余内生菌;各植物之间分离得到放线菌数目差别很大,在紫花地丁、地黄和白茅的根际土壤中分离得到较多的放线菌,且菌株形态各异;即使采自同一地域的样品,分离得到的放线菌仍有很大差别;对部分菌株进行16S r RNA基因测序,最终选取3株形态比较特异的菌株st1、st4和zh8进行多相分类学鉴定,分别为野野村菌属、放线产孢菌属和小单孢菌属的三株新种。(2)对筛选得到的菌株进行抑细菌测定发现,共20株菌对枯草芽孢杆菌或藤黄微球菌具有较好的抑制活性(抑菌直径大于10mm):大部分有活性菌株为根际放线菌,仅gq1、gq12和sc6三株为内生放线菌;gt9、ht2和st18对两种细菌有较好的抑制作用,抑菌直径达25mm以上。对筛选得到的菌株进行抑真菌测定发现,共16株放线菌发酵液的对两种或两种以上真菌具有较好抑制作用(抑菌直径大于5mm),大部分仍为根际放线菌,仅gq1、gq12和hl7为内生放线菌;gq1和gq12对大豆疫霉病菌具有很好的抑制活性,抑菌直径达30mm以上,而st6、st14和dht1对所有真菌均具有抑制作用。菌株发酵液对细菌和真菌均有抑制作用的菌株有14株,仅对细菌有活性的菌株有6株(gt3、gt8、ht2、ht7、sc6、st18),仅对真菌有活性的菌株有2株(zt1和hl7)。在对峙实验中,共37株菌对两种或两种以上真菌具有较好活性(抑菌直径大于2mm)。在十字交叉法测定中有活性的菌株在对峙法测定时均有活性;菌株对细菌和对真菌的活性之间没有必然联系。所有有活性菌株均为类链霉菌,其它菌株基本无活性,这可能是因为其它菌株如小单孢菌株不产气生菌丝,在培养基上生长状态比较弱,不利于抗生素的产生。(3)st14菌株对10种真菌具有广谱抗性,通过16S r RNA基因测序,菌株st14与马铃薯疮痂病致病菌Streptomyces scabies具有高达99.66%的相似性,对其进行化合物分离。从st14菌株中分离得到的化合物与伴刀球霉素A(Concanamycins A)结构相同。从链霉菌中分离得到新型抗生素的概率大大降低,而稀有放线菌的分离筛选仍然存在很多问题,稀有放线菌的不易培养,使其化合物的分离受到严重制约,对稀有放线菌的研究仍然任重道远。(4)菌株st1的多相分类学鉴定:通过16S r RNA基因测序,菌株st1属于野野村菌属(Nonomuraea),与Nonomuraea rosea GW12687T(98.91%)、Nonomuraea solani NEAU-Z6T(98.44%)、Nonomuraea rhizophila YIM67092T(98.24%)和Nonomuraea monospora PT708T(98.02%)四株典型菌株具有最高的相似性,系统发育分析显示菌株st1与其相似菌株形成独立的分支。菌株st1与这四株野野村典型菌株在孢子形态、Na Cl耐受、部分生理生化实验和主要脂肪酸组成上均有很大不同,并且与相似菌株的DNA同源性均低于新菌鉴定的阈值70%,因此判断菌株st1为野野村菌属的一个新菌,命名为Nonomuraea shaanxiensis,典型菌株为NEAU-st1T,分别在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC 4.7096T)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSM 45877T)进行保藏。(5)菌株st4的多相分类学鉴定:16S r RNA基因测序显示,菌株st4与Actinomycetospora rishiriensis RI109-Li102T(99.4%)、Actinomycetospora corticicola 014-5T(99.1%)、Actinomycetospora chiangmaiensis YIM 0006T(98.8%)和Actinomycetospora iriomotensis IR73-Li102T(98.2%)具有最高的相似性,但DNA-DNA同源分析将他们区分开来。菌株st4的化学分类学特征如肽聚糖氨基酸类型、全细胞水解物、优势甲基萘醌和磷酸类脂组成均支持菌株st4属于产孢放线菌属(Actinomycetospora)。但菌株st4在基内菌丝上形成孢子囊,与其它典型菌株具有很大不同。Na Cl耐受和碳源利用等实验也证明菌株st4与其相似菌株不同。因此判断菌株st4为产孢放线菌属的一株新菌,命名为Actinomycetospora atypica,典型菌株为NEAU-st4T,分别在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC 4.7093T)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSM 45873T)进行保藏。(6)菌株zh8的多相分类学鉴定:16S r RNA基因相似性分析显示,菌株zh8属于小单孢菌属(Micromonospora),与Micromonospora chokoriensis 2-19(6)T(99.9%)、Micromonospora saelicesensis Lupac 09T(99.3%)和Micromonospora lupini Lupac 14NT(99.0%)具有最高的相似性。gyr B基因分析也证明菌株zh8属于小单孢菌属。菌株zh8的磷脂类型包含双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇;全细胞水解糖含鼠李糖、木糖、葡萄糖和半乳糖;细胞壁氨基酸含Qg消旋-二氨基庚二酸和甘氨酸;菌株zh8的优势醌为MK-10(H4)、MK-10(H2)和MK-10(H6);菌株zh8的主要脂肪酸含有iso-C15:0、C16:0、C17:0。DNA-DNA杂交结果以及一些生理生化特征区分了菌株zh8与其相似菌株。因此判定菌株zh8为小单孢菌属的一个新种,命名为Micromonospora violae,典型菌株为NEAU-zh8T,在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC 4.7102T)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSM 45888T)进行保藏。
【关键词】：植物内生菌 根际放线菌 活性化合物 多相分类学 Nonomuraea shaanxiensis Actinomycetospora atypica Micromonospora violae
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S182
【目录】：

• 摘要9-11
• 英文摘要11-14
• 1 前言14-21
• 1.1 放线菌研究现状14-15
• 1.2 选择性分离方法15-17
• 1.2.1 湿热和干热处理16
• 1.2.2 选择抗菌药物16
• 1.2.3 离心16
• 1.2.4 其它方法16-17
• 1.3 从未被开发的资源中分离放线菌17-20
• 1.3.1 植物内生菌18-19
• 1.3.2 极端环境19
• 1.3.3 海洋放线菌19-20
• 1.3.4 其它环境20
• 1.4 研究目的与意义20
• 1.5 课题来源20-21
• 2 材料与方法21-36
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 实验样品来源21
• 2.1.2 菌株来源21-22
• 2.1.3 实验仪器22-23
• 2.1.4 实验试剂23
• 2.2 主要培养基及配制方法23-25
• 2.2.1 分离培养基23
• 2.2.2 纯化培养基23
• 2.2.3 发酵培养基23-24
• 2.2.4 生测培养基24
• 2.2.5 液体培养基24
• 2.2.6 形态观察培养基24-25
• 2.2.7 生理生化培养基25
• 2.3 实验方法25-36
• 2.3.1 根际放线菌的分离25-26
• 2.3.2 植物根内生放线菌的分离26
• 2.3.3 活性测定26-27
• 2.3.4 化合物分离27
• 2.3.5 多相分类学鉴定27-36
• 3 结果与分析36-70
• 3.1 筛选得到的菌株36-38
• 3.2 活性测定结果38-42
• 3.2.1 抑细菌活性测定结果38-39
• 3.2.2 抑真菌活性测定结果39-42
• 3.3 化合物分离结果42
• 3.4 放线菌新菌鉴定结果42-70
• 3.4.1 菌株st1多相分类学鉴定结果43-51
• 3.4.2 菌株st4多相分类学鉴定结果51-59
• 3.4.3 菌株zh8多相分类学鉴定结果59-70
• 4 讨论70-72
• 4.1 分离材料的选择70
• 4.2 选择性分离方法70
• 4.3 放线菌的抑菌活性70-71
• 4.4 伴刀球霉素A71-72
• 5 结论72-73
• 致谢73-74
• 参考文献74-81
• 附录81-85
• 攻读博士学位期间发表的学术论文85-86

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