桔小实蝇发育阶段转变前后miRNA分析及miR-309a调控卵巢发育的分子机制
发布时间：2021-08-10 22:45
microRNA（miRNA）是一类广泛存在于生物体内长度约22 bp的内源性小分子非编码RNA,在转录后水平调控基因的表达。miRNA因参与调控昆虫的生长发育、生殖、免疫和抗药性等诸多生理过程,近年来逐渐成为昆虫发育生物学领域的一个研究热点。桔小实蝇Bactrocera dorsalis是一种危险性的果蔬害虫,寄主范围广,造成的经济损失严重,多个国家和地区将其列为检疫性对象。目前,桔小实蝇已成为我国果蔬产业健康发展的巨大威胁,探索桔小实蝇新的防控策略显得尤为迫切。据此,本学位论文以桔小实蝇为研究对象,基于不同发育阶段转变前后高通量测序,在注释和鉴定miRNA的基础上筛选差异表达的miRNA;利用qRT-PCR,解析卵和蛹期与发育相关的miRNA表达谱,同时结合使用miRNA类似物/抑制剂探究miRNA参与调控化蛹及羽化进程的功能;最后聚焦miR-309a,综合运用qRT-PCR、靶基因预测、双荧光素酶报告系统、RNA结合蛋白免疫沉淀和外源激素处理等技术和方法,初步提出JH-miR-309a-pnr-Vg related genes通路调控桔小实蝇生殖的分子机理。主要研究结果如下:1桔...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：155 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
SmallRNAs文库构建流程图（引自百迈客）
第二章桔小实蝇发育阶段转变前后miRNA鉴定19样品原始reads低质量reads含"N"reads短于18ntreads长于18ntreads高质量readsQ30百分比SamplesRaw_readsLow_qualityContaining"N"readsLength<18Length>30Clean_readsQ30(%)L1L-34922580500105977549384123768963998.52L2E-13942471700151683139522853395560198.69L2E-24275830801165869867135153438609498.85L2E-33975609302273478427094713431183698.63L2L-15064102400290930837622634396945398.57L2L-23447420400232292717850553036622298.66L2L-34756301200393120325129564111885398.6L3E-14610475700323344224731734039814298.67L3E-24476560200839512214525273491795398.68L3E-33594567800636720415301222804835298.64LW-14372527901699975611769373554858598.81LW-23757753902171204441740643169142998.65LW-34073745002192951528600023594793198.81PE-13257776800132611522743302897732398.82PE-23706400100241326321463173250442198.81PE-34045728002280955937530263389469398.71PL-14089681500218791832405993546829898.51PL-23782159000398331118490233198925698.19PL-34379396700623105923686763519423298.66AE-142821739001071573414718333063417298.85AE-24847092000245865030436194296865198.56AE-35086476700358787725971054467978598.59图2.3桔小实蝇smallRNAs长度和丰度分布Figure2.3LengthdistributionofsequencedsmallRNAsinB.dorsalis
西南大学博士学位论文22进一步筛选（剔除无1个样品reads大于100TPM的miRNA）和定量验证（7个miRNAs成功设计引物且相对表达量均高于1），7个桔小实蝇knownmiRNAs全部保留并进行后续分析（表2.4）。其中，4个knownmiRNAs，包括bdo-miR-278、bdo-miR-987、bdo-miR-31b和bdo-miR-317序列高度保守，分别与黑腹果蝇、黑果蝇Drosophilavirilis和埃及伊蚊的相关序列完全一致；其他3个knownmiRNAs包括bdo-miR-311、bdo-miR-281和bdo-miR-285分别与黑腹果蝇的相关序列相差1至2个碱基（图2.4）。综合上述分析结果，测序共获得83个桔小实蝇knownmiRNAs，其中79个将进行后续分析。表2.4桔小实蝇knownmiRNA鉴定Table2.4IdentificationofknownmiRNAinB.dorsalisCt(template)，使用表达量最高阶段作为模板的定量值；U6作为内参基因，使用2-ΔΔCt方法进行数据分析，Ct值30经2-ΔΔCt方法计算后的相对表达量为1。Ct(template),theqPCRvalueoftemplateusingthecDNAofthehighestexpressionstage;U6asreferencegenewasusedtonormalizetheexpressionofmiRNAsbytheanalysismethodof2-ΔΔCt;therelativeexpressionwas1by2-ΔΔCtmethodusingtheCtvalueof30.图2.4桔小实蝇与其他物种miRNA序列比对鉴定到的7个knownmiRNA（A）miRNA序列高度保守，与近缘种完全一致。（B）miRNA序列与近缘种存在1至2个碱基差异。Figure2.4Identificationof7knownmiRNAsofB.dorsaliscomparedwithotherspecies(A)miRNAsequencesarehighlyconservative,andthesamesequencesintheclosespecies.(B)miRNAsequencehasoneortwomismatchescomparedwiththeclosespecies.miRNA名称上游引物熔解（单峰）Ct值相对表达量miRNAnamePrimer-FMeltingcurve(singlepeak)Ct(template)Relativ
本文编号：3334908
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：155 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
SmallRNAs文库构建流程图（引自百迈客）
第二章桔小实蝇发育阶段转变前后miRNA鉴定19样品原始reads低质量reads含"N"reads短于18ntreads长于18ntreads高质量readsQ30百分比SamplesRaw_readsLow_qualityContaining"N"readsLength<18Length>30Clean_readsQ30(%)L1L-34922580500105977549384123768963998.52L2E-13942471700151683139522853395560198.69L2E-24275830801165869867135153438609498.85L2E-33975609302273478427094713431183698.63L2L-15064102400290930837622634396945398.57L2L-23447420400232292717850553036622298.66L2L-34756301200393120325129564111885398.6L3E-14610475700323344224731734039814298.67L3E-24476560200839512214525273491795398.68L3E-33594567800636720415301222804835298.64LW-14372527901699975611769373554858598.81LW-23757753902171204441740643169142998.65LW-34073745002192951528600023594793198.81PE-13257776800132611522743302897732398.82PE-23706400100241326321463173250442198.81PE-34045728002280955937530263389469398.71PL-14089681500218791832405993546829898.51PL-23782159000398331118490233198925698.19PL-34379396700623105923686763519423298.66AE-142821739001071573414718333063417298.85AE-24847092000245865030436194296865198.56AE-35086476700358787725971054467978598.59图2.3桔小实蝇smallRNAs长度和丰度分布Figure2.3LengthdistributionofsequencedsmallRNAsinB.dorsalis
西南大学博士学位论文22进一步筛选（剔除无1个样品reads大于100TPM的miRNA）和定量验证（7个miRNAs成功设计引物且相对表达量均高于1），7个桔小实蝇knownmiRNAs全部保留并进行后续分析（表2.4）。其中，4个knownmiRNAs，包括bdo-miR-278、bdo-miR-987、bdo-miR-31b和bdo-miR-317序列高度保守，分别与黑腹果蝇、黑果蝇Drosophilavirilis和埃及伊蚊的相关序列完全一致；其他3个knownmiRNAs包括bdo-miR-311、bdo-miR-281和bdo-miR-285分别与黑腹果蝇的相关序列相差1至2个碱基（图2.4）。综合上述分析结果，测序共获得83个桔小实蝇knownmiRNAs，其中79个将进行后续分析。表2.4桔小实蝇knownmiRNA鉴定Table2.4IdentificationofknownmiRNAinB.dorsalisCt(template)，使用表达量最高阶段作为模板的定量值；U6作为内参基因，使用2-ΔΔCt方法进行数据分析，Ct值30经2-ΔΔCt方法计算后的相对表达量为1。Ct(template),theqPCRvalueoftemplateusingthecDNAofthehighestexpressionstage;U6asreferencegenewasusedtonormalizetheexpressionofmiRNAsbytheanalysismethodof2-ΔΔCt;therelativeexpressionwas1by2-ΔΔCtmethodusingtheCtvalueof30.图2.4桔小实蝇与其他物种miRNA序列比对鉴定到的7个knownmiRNA（A）miRNA序列高度保守，与近缘种完全一致。（B）miRNA序列与近缘种存在1至2个碱基差异。Figure2.4Identificationof7knownmiRNAsofB.dorsaliscomparedwithotherspecies(A)miRNAsequencesarehighlyconservative,andthesamesequencesintheclosespecies.(B)miRNAsequencehasoneortwomismatchescomparedwiththeclosespecies.miRNA名称上游引物熔解（单峰）Ct值相对表达量miRNAnamePrimer-FMeltingcurve(singlepeak)Ct(template)Relativ
本文编号：3334908
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