传染性法氏囊病病毒吸附受体的鉴定及致炎机制研究
发布时间：2021-08-31 19:28
鸡传染性法氏囊病（IBD）是一种严重危害世界养禽业的疾病,该病被世界动物卫生组织（OIE）列为重要家禽疫病之一。1990年以后,IBD的防控局势发生了巨大改变,不同毒力的传染性法氏囊病病毒（IBDV）毒株开始出现。超强毒（vvIBDV）主要在我国流行,导致炎症、免疫抑制及幼鸡的高死亡率。研究IBDV的致病机制,找到防控重点,对于疾病防治具有重要意义。目前对于IBDV具体致病机制的研究仍不全面,本研究主要从IBDV病毒吸附及致炎机理两个方面,对IBDV致病机制进行进一步探索。病毒感染的第一个步骤就是与受体结合并进入细胞,目前已知IBDV VP2蛋白是决定病毒与细胞结合及细胞嗜性的主要病毒蛋白。为了找到IBDV可能受体,并更深入的了解IBDV复制过程,本实验通过质谱检测IBDV衣壳蛋白VP2的互作蛋白,筛选到膜蛋白CD74分子。免疫共沉淀实验验证了CD74胞外区与VP2的互作,并验证了CD74对于IBDV复制能力及吸附作用的影响。通过Western blot、qPCR及ELD50实验结果可见,病毒在CD74敲低细胞系中复制减弱,而CD74过表达则促进IBDV的复制。激...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：79 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
VP2互作蛋白质谱结果
中国农业科学院博士学位论文第二章IBDV吸附受体CD74的鉴定22Microscope）进行观察，利用ZEN2software导出图片。2.1.12CD74敲低细胞系的构建慢病毒包装由上海吉玛公司完成，shRNA序列为sense5′-GCGAUGAGAACGGUGACUATT-3′,antisense5′-UAGUCACCGUUCUCAUCGCTT-3′。DT40细胞感染慢病毒，感染后的细胞利用流式分选系统（MoFloXDP）进行红色荧光（RFP）分眩慢病毒转导阳性细胞率通过荧光显微镜、流式细胞仪检测，敲低效率由WesternBlot与qPCR检测。2.2结果2.2.1筛选CD74作为IBDV受体疑似分子之前的研究结果表明IBDV衣壳蛋白VP2对于病毒与细胞互作及抗原性具有重要作用。为了筛选可能的受体分子，本实验利用免疫沉淀实验进行VP2互作蛋白筛选，将银染得到的VP2及阴性对照差异条带送质谱测序。结果如图2-1所示。一系列VP2疑似互作蛋白被检测到，其中包括CD74分子。图2-1VP2互作蛋白质谱结果Figure2-1LC/MSresultsforproteininteractedwithVP2为了进一步确认VP2与CD74胞外区的互作，利用免疫共沉淀实验检测CD74胞外区与vvIBDVGx毒株及HLJ0405毒株VP2蛋白的互作，结果如图2-2所示，正反拉结果表明CD74与vvIBDVVP2具有相互作用。图2-2CD74与VP2相互作用Figure2-2Co-ipresultsforCD74andIBDVVP2
中国农业科学院博士学位论文第二章IBDV吸附受体CD74的鉴定23为了检测CD74在鸡体内的分布，利用qPCR实验检测了SPF鸡心脏、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、胸腺及法氏囊中CD74的转录情况，结果如2-3所示，CD74在IBDV靶器官法氏囊中转录水平最高。图2-3鸡CD74脏器分布Figure2-3DistributionforchickenCD74为了探索CD74在IBDV感染后的上调，将SPF接种vvIBDV，感染后12、24、36h收集法氏囊进行CD74转录水平检测，如图2-4所示，CD74在IBDV感染后12h相对于非感染组明显上调（P＜0.05）。图2-4IBDV感染后CD74mRNA变化情况Figure2-4mRNAlevelofchickenCD74aftervvIBDVinfection2.2.2CD74下调抑制IBDV复制为了检测CD74是否参与IBDV感染过程，将CD74Ii-2亚型在DT40细胞中下调表达，24h后感染1MOIvvIBDV，感染后24、48和72h收集细胞上清及沉淀进行病毒复制水平检测。WesternBlot结果可见CD74干扰后DT40细胞中CD74表达水平下调（图2-5）。WesternBlot结果表明CD74下调减弱IBDV复制，可见VP2表达在感染后24~48h下降（图2-6）。qPCR结果表明，CD74下调表达使IBDV拷贝数在感染后48h下降6.34倍（图2-7，P＜0.05），同时IBDVELD50滴度下降14.0倍（图2-8，P＜0.05），与干扰阴性对照相比。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡传染性法氏囊病的流行与防控[J]. 王笑梅. 北方牧业. 2013(22)
[2]减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因[J]. 李龙,方维焕,樊拥军,许健,方立,李建荣,于涟. 生物工程学报. 2004(03)
[3]鸡传染性法氏囊病超强毒毒株的分离和初步鉴定[J]. 李德山,武志强,陈冠春,王笑梅,谷守林,郝桂玉,尹训南. 中国畜禽传染病. 1991(06)
[4]北京地区鸡传染性法氏囊病病原分离[J]. 周蛟,刘福致,陈丽永,王淑娟. 中国兽医杂志. 1982(07)
本文编号：3375482
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：79 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
VP2互作蛋白质谱结果
中国农业科学院博士学位论文第二章IBDV吸附受体CD74的鉴定22Microscope）进行观察，利用ZEN2software导出图片。2.1.12CD74敲低细胞系的构建慢病毒包装由上海吉玛公司完成，shRNA序列为sense5′-GCGAUGAGAACGGUGACUATT-3′,antisense5′-UAGUCACCGUUCUCAUCGCTT-3′。DT40细胞感染慢病毒，感染后的细胞利用流式分选系统（MoFloXDP）进行红色荧光（RFP）分眩慢病毒转导阳性细胞率通过荧光显微镜、流式细胞仪检测，敲低效率由WesternBlot与qPCR检测。2.2结果2.2.1筛选CD74作为IBDV受体疑似分子之前的研究结果表明IBDV衣壳蛋白VP2对于病毒与细胞互作及抗原性具有重要作用。为了筛选可能的受体分子，本实验利用免疫沉淀实验进行VP2互作蛋白筛选，将银染得到的VP2及阴性对照差异条带送质谱测序。结果如图2-1所示。一系列VP2疑似互作蛋白被检测到，其中包括CD74分子。图2-1VP2互作蛋白质谱结果Figure2-1LC/MSresultsforproteininteractedwithVP2为了进一步确认VP2与CD74胞外区的互作，利用免疫共沉淀实验检测CD74胞外区与vvIBDVGx毒株及HLJ0405毒株VP2蛋白的互作，结果如图2-2所示，正反拉结果表明CD74与vvIBDVVP2具有相互作用。图2-2CD74与VP2相互作用Figure2-2Co-ipresultsforCD74andIBDVVP2
中国农业科学院博士学位论文第二章IBDV吸附受体CD74的鉴定23为了检测CD74在鸡体内的分布，利用qPCR实验检测了SPF鸡心脏、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、胸腺及法氏囊中CD74的转录情况，结果如2-3所示，CD74在IBDV靶器官法氏囊中转录水平最高。图2-3鸡CD74脏器分布Figure2-3DistributionforchickenCD74为了探索CD74在IBDV感染后的上调，将SPF接种vvIBDV，感染后12、24、36h收集法氏囊进行CD74转录水平检测，如图2-4所示，CD74在IBDV感染后12h相对于非感染组明显上调（P＜0.05）。图2-4IBDV感染后CD74mRNA变化情况Figure2-4mRNAlevelofchickenCD74aftervvIBDVinfection2.2.2CD74下调抑制IBDV复制为了检测CD74是否参与IBDV感染过程，将CD74Ii-2亚型在DT40细胞中下调表达，24h后感染1MOIvvIBDV，感染后24、48和72h收集细胞上清及沉淀进行病毒复制水平检测。WesternBlot结果可见CD74干扰后DT40细胞中CD74表达水平下调（图2-5）。WesternBlot结果表明CD74下调减弱IBDV复制，可见VP2表达在感染后24~48h下降（图2-6）。qPCR结果表明，CD74下调表达使IBDV拷贝数在感染后48h下降6.34倍（图2-7，P＜0.05），同时IBDVELD50滴度下降14.0倍（图2-8，P＜0.05），与干扰阴性对照相比。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡传染性法氏囊病的流行与防控[J]. 王笑梅. 北方牧业. 2013(22)
[2]减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因[J]. 李龙,方维焕,樊拥军,许健,方立,李建荣,于涟. 生物工程学报. 2004(03)
[3]鸡传染性法氏囊病超强毒毒株的分离和初步鉴定[J]. 李德山,武志强,陈冠春,王笑梅,谷守林,郝桂玉,尹训南. 中国畜禽传染病. 1991(06)
[4]北京地区鸡传染性法氏囊病病原分离[J]. 周蛟,刘福致,陈丽永,王淑娟. 中国兽医杂志. 1982(07)
本文编号：3375482
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3375482.html
最近更新
教材专著
