弓形虫与猪巨噬细胞的互作特征以及FASⅡ和磷酸转运在虫体生长中的生理功能

发布时间：2021-10-22 12:25

　　刚地弓形虫是一种顶复门原虫,其感染宿主非常广泛。研究表明弓形虫在寄生过程中,不仅能够调节宿主基因的表达,而且还可以改变自身的代谢等生物过程以适应不同的寄生环境。弓形虫与宿主的互作研究主要以模式动物小鼠为主,然而越来越多的证据表明不同宿主感染弓形虫后的病原-宿主互作机制不尽相同。猪是弓形虫的易感宿主,感染后导致母猪流产、死胎等,造成巨大的经济损失。然而目前关于猪与弓形虫互作的研究还非常有限。本研究以猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）为宿主细胞,选取弓形虫Me49虫株作为代表虫株,利用Dual RNA-seq技术进行互作转录组分析。我们的结果揭示了猪肺泡巨噬细胞感染弓形虫后独特的应答反应,同时我们还发现弓形虫适应胞内寄生生活的代谢途径并对其中两个（II型脂肪酸合成与磷酸盐的吸收）在虫体生长繁殖中生理功能进行了研究,主要内容如下:（1）互作转录组数据分析对获得的高质量测序数据分析表明猪肺泡巨噬细胞感染弓形虫以后虫体与宿主的转录谱均发生显著改变,猪肺泡巨噬细胞中上调基因主要与免疫应答相关,下调基因主要集中在细胞连接。对差异表达基因进行细致分析揭示了猪巨噬细胞与小鼠巨噬细胞响应弓形虫感染的差别。II... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：127 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
    1.1 弓形虫生活史
    1.2 弓形虫的危害
    1.3 抗弓形虫感染的免疫应答研究
    1.4 弓形虫对宿主细胞的入侵与修饰
    1.5 弓形虫免疫逃避机制
    1.6 弓形虫在宿主细胞内的营养物质合成与转运研究
        1.6.1 弓形虫脂肪酸代谢研究
        1.6.2 弓形虫转运蛋白研究
2 研究目的与意义
3 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物
        3.1.2 虫株、细胞和菌株
        3.1.3 载体与质粒
        3.1.4 引物
    3.2 主要仪器与试剂
        3.2.1 主要仪器
        3.2.2 主要试剂盒
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 主要试剂的配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 细胞传代培养
        3.3.2 细胞及虫株的冻存及复苏
        3.3.3 互作转录组测序样品的收集
        3.3.4 转录组样品文库构建及测序
        3.3.5 测序数据分析
        3.3.6 基因组DNA提取方法
        3.3.7 RNA提取及反转录
        3.3.8 荧光定量q RT-PCR分析转录组差异基因
        3.3.9 连接产物的转化
        3.3.10 质粒提取
        3.3.11 切胶回收目的DNA片段
        3.3.12 CRISPR/Cas9 质粒的构建
        3.3.13 具有同源臂重组质粒的构建
        3.3.14 弓形虫基因敲除虫株的构建
        3.3.15 间接免疫荧光
        3.3.16 弓形虫复制实验
        3.3.17 空斑实验
        3.3.18 弓形虫入侵检测
        3.3.19 弓形虫逸出检测
        3.3.20 CCCP抑制剂对弓形虫体外生长影响的检测
        3.3.21 小鼠毒力实验
        3.3.22 荷虫量检测
        3.3.23 酵母试验
4 结果与分析
    4.1 互作转录组测序及分析
        4.1.1 获得高质量的RNA样品
        4.1.2 获得高质量的测序数据
        4.1.3 测序序列具有较高的比对率
        4.1.4 生物学重复样品间具有较高的相关性
        4.1.5 差异基因分析及验证
        4.1.6 猪肺泡巨噬细胞感染弓形虫前后差异表达基因功能分析
        4.1.7 弓形虫适应细胞内寄生的潜在机制分析
    4.2 Tg Fab D基因的敲除及功能研究
        4.2.1 FabD在弓形虫进入宿主细胞后表达升高
        4.2.2 Tg Fab D敲除虫株的构建
        4.2.3 ΔFabD表型分析
    4.3 弓形虫磷酸盐转运蛋白功能研究
        4.3.1 弓形虫编码3个潜在的磷酸盐转运蛋白
        4.3.2 弓形虫磷酸盐转运蛋白进化分析揭示不同的保守性
        4.3.3 弓形虫磷酸盐转运蛋白生物信息学分析
        4.3.4 弓形虫磷酸盐转运蛋白的定位研究
        4.3.5 弓形虫磷酸盐转运蛋白基因的敲除/敲低
        4.3.6 弓形虫磷酸盐转运蛋白基因敲除/敲低虫株表型分析
        4.3.7 获得PiT2回补虫株
        4.3.8 PiT2回补虫株表型实验
        4.3.9 CCCP抑制弓形虫在体外的生长
        4.3.10 利用重组酵母实验验证弓形虫磷酸盐转运蛋白的活性
5 讨论
    5.1 转录组学在宿主-病原互作中的应用研究
    5.2 猪肺泡巨噬细胞与弓形虫互作转录组研究
        5.2.1 样品制备与测序
        5.2.2 互作转录组数据分析揭示猪肺泡巨噬细胞独特的应答反应
        5.2.3 弓形虫进入宿主细胞前后差异表达基因功能分析
    5.3 FASⅡ脂肪酸合成途径在弓形虫中的生理功能
    5.4 弓形虫磷酸盐转运蛋白对弓形虫在体内外生长具有关键作用
6 结论
参考文献
致谢
附录 A
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]妊娠期妇女弓形虫感染现状及妊娠结局分析[J]. 吴晓君,王优君.  中国计划生育学杂志. 2020(06)
[2]国内猪、牛和鸡弓形虫感染情况及危险因素研究进展[J]. 郑斌,李金娜.  中国动物检疫. 2016(03)
[3]干扰素诱导的GTP酶及其在抗感染先天免疫系统中的作用[J]. 张艳,叶向群.  生命的化学. 2008(05)
[4]全国人体重要寄生虫病现状调查报告[J]. 许隆祺,陈颖丹,孙凤华,蔡黎,方悦怡,王丽萍,刘新,李莉莎,冯宇,李辉.  中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2005(S1)



本文编号：3451095