H9N2内部基因盒对H5亚型重配禽流感病毒致病力的影响及其机制研究

发布时间：2021-11-16 05:04

　　S基因型H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）是当前的主流基因型,并以完整内部基因盒的方式频繁地为H7N9、H10N8和H5N6等致人感染的新型重配流感病毒提供全套内部基因。当前H5和H9亚型AIV在国内共同流行,使得两者极易发生自然重配,并且禽及人感染病例中均已出现了内部基因完全来源于H9N2的新型重配H5病毒。因此,为了评估此类重配病毒的生物危害,迫切需要探讨当前优势S基因型H9N2病毒的内部基因盒对不同进化分支H5病毒致病力的影响。S基因型H9N2病毒是在国内前期流行的H基因型骨架上先后引入了 G1-like进化谱系的M和PB2基因,即分别替换掉F/98-like进化谱系的M和PB2基因而形成的。然而,不同H9N2进化谱系的PB2和M基因对于重配H5病毒会产生什么样的生物学效应?其相关的分子机制又如何?本文研究了不同基因型H9N2内部基因盒对当前优势流行H5亚型AIV致病力的影响,并进一步探究了其致病力差异的分子机制和宿主因素。我们发现S基因型H9N2的全套内部基因能明显降低重配H5病毒对鸡和小鼠的致病力。但是,与S基因型相比,含H基因型内部... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：150 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
综述
    1.1 引言
    1.2 H9N2亚型禽流感病毒在我国的出现和发展
    1.3 H9N2病毒在我国的进化
    1.4 H9N2亚型禽流感病毒在我国生物学特性的演变
    1.5 H9N2亚型禽流感病毒在我国频繁提供内部基因给其它亚型流感病毒
        1.5.1 H9N2亚型禽流感病毒提供内部基因给H5亚型病毒
        1.5.2 H9N2亚型禽流感病毒提供内部基因给H7亚型病毒
        1.5.3 H9N2亚型禽流感病毒提供内部基因给其它亚型病毒
    1.6 H9N2亚型禽流感病毒在我国家禽和人类及其它哺乳动物的适应性
        1.6.1 表面蛋白
        1.6.2 内部蛋白
    1.7 H9N2亚型禽流感病毒在我国感染家禽和人类的概况
    1.8 总结
    参考文献
第一章 S基因型H9N2内部基因盒对H5亚型重配病毒致病力的影响
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 毒株
        2.2.2 细胞、鸡胚和实验动物
        2.2.3 主要试剂
        2.2.4 主要仪器
    2.3 方法
        2.3.1 重配病毒的拯救
        2.3.2 病毒的滴定
        2.3.3 病毒生长曲线的测定
        2.3.4 聚合酶活性的检测
        2.3.5 SPF鸡致病性和传播性实验
        2.3.6 小鼠致病性实验
    2.4 结果
        2.4.1 内部基因盒来自S基因型H9N2的H5重配病毒的拯救
        2.4.2 S基因型H9N2病毒内部基因盒降低H5重配病毒在体外细胞中的复制能力
        2.4.3 S基因型H9N2病毒内部基因盒降低H5重配病毒聚合酶活性
        2.4.4 S基因型H9N2病毒内部基因盒降低H5重配病毒对鸡的毒力和复制能力
        2.4.5 传播效力试验
        2.4.6 S基因型H9N2病毒内部基因盒降低H5重配病毒对小鼠的毒力和复制能力
        2.4.7 S基因型H9N2病毒内部基因盒对重配H5病毒刺激宿主细胞因子表达的影响
    2.5 讨论
    参考文献
第二章 H9N2不同进化谱系PB2和M基因对重配H5病毒在禽类动物模型上致病性的影响及机制探索
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 毒株
        3.2.2 细胞、鸡胚和实验动物
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 主要仪器
        3.2.5 分子生物学软件
    3.3 方法
        3.3.1 基因序列分析
        3.3.2 重配病毒的拯救
        3.3.3 重配病毒在禽类细胞上复制能力的测定
        3.3.4 Western blot方法检测病毒蛋白的表达
        3.3.5 免疫荧光试验
        3.3.6 不同进化谱系PB2影响H9N2病毒RNP聚合酶活性检测
        3.3.7 电镜试验
    3.4 结果
        3.4.1 携带G1-like PB2和G1-like M基因的H9N2病毒在禽源H9N2病毒中占主导地位
        3.4.2 内部基因来自H9N2病毒的重配H5病毒的产生
        3.4.3 G1-like M和G1-like PB2基因增强重配H5病毒对鸡的毒力和复制能力
        3.4.4 G1-like M和G1-like PB2基因增强重配H5病毒在禽类细胞系上的复制能力和蛋白表达水平
        3.4.5 G1-like PB2蛋白提高S基因型H9N2病毒在禽类细胞系上的聚合酶活性
        3.4.6 G1-like PB2基因增强PB2蛋白在禽类细胞上核输入能力
        3.4.7 G1-like M基因增加重配H5病毒在禽类细胞上的球形病毒粒子
        3.4.8 G1-like M基因增强M1蛋白在禽类细胞上协助RNP核输出的能力
    3.5 讨论
    参考文献
第三章 H9N2不同进化谱系PB2和M基因对重配H5病毒在哺乳类动物模型上致病性的影响及机制探索
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 毒株
        4.2.2 细胞、鸡胚和实验动物
        4.2.3 主要试剂
        4.2.4 主要仪器
        4.2.5 分子生物学软件
    4.3 方法
        4.3.1 基因序列分析
        4.3.2 重配病毒的拯救
        4.3.3 重配病毒在哺乳类动物细胞复制能力的测定
        4.3.4 病毒蛋白表达水平的检测
        4.3.5 免疫荧光试验
        4.3.6 聚合酶活性测定
        4.3.7 电镜试验
    4.4 结果
        4.4.1 携带G1-like PB2和M基因的H9N2病毒在我国H9N2病毒中占主导地位
        4.4.2 重配病毒在哺乳类动物细胞感染性测定
        4.4.3 G1-like M和G1-like PB2基因增强重配H5病毒对小鼠的毒力和复制能力
        4.4.4 G1-like M和G1-like PB2基因增强重配H5病毒在哺乳动物细胞系上的复制能力和蛋白表达水平
        4.4.5 G1-like PB2蛋白提高S基因型H9N2病毒在哺乳动物细胞系上的聚合酶活性
        4.4.6 G1-like PB2基因增强PB2蛋白在哺乳动物细胞系上核输入能力
        4.4.7 G1-like M基因增加重配H5病毒在哺乳动物细胞上的球形病毒粒子
        4.4.8 G1-like M基因增强M1蛋白在哺乳动物细胞上协助RNP核输出的能力
    4.5 讨论
    参考文献
第四章 基于TMT技术研究含S和H基因型H9N2内部基因盒的重配H5病毒感染鸡肺脏的差异表达蛋白
    5.1 引言
    5.2 材料
        5.2.1 毒株
        5.2.2 细胞、鸡胚和实验动物
        5.2.3 主要试剂
        5.2.4 主要仪器
    5.3 方法
        5.3.1 SPF鸡感染性实验
        5.3.2 蛋白样品制备
        5.3.3 蛋白浓度测定
        5.3.4 SDS-PAGE电泳样品检测实验
        5.3.5 蛋白还原烷基化及酶解
        5.3.6 蛋白标记及质谱分析
        5.3.7 数据分析
        5.3.8 生物信息学分析
        5.3.9 qRT-PCR验证
    5.4 结果
        5.4.1 比较H5/S和H5/H重配病毒对SPF鸡的毒力
        5.4.2 比较H5/S和H5/H重配病毒在SPF鸡肺中的复制能力
        5.4.3 筛选H5/H和H5/S重配病毒感染鸡的肺脏差异蛋白组
        5.4.4 差异蛋白组的生物信息功能分析
        5.4.5 差异蛋白的qRT-PCR验证
    5.5 讨论
    参考文献
全文小结
致谢
攻读博士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]Highly pathogenic avian influenza H5N1 Clade 2.3.2.1c virus in migratory birds,2014–2015[J]. Yuhai Bi,Jianjun Chen,Zhenjie Zhang,Mingxin Li,Tianlong Cai,Kirill Sharshov,Ivan Susloparov,Alexander Shestopalov,Gary Wong,Yubang He,Zhi Xing,Jianqing Sun,Di Liu,Yingxia Liu,Lei Liu,Wenjun Liu,Fumin Lei,Weifeng Shi,George F.Gao.  Virologica Sinica. 2016(04)
[2]Endemicity of H9N2 and H5N1 avian influenza viruses in poultry in China poses a serious threat to poultry industry and public health[J]. Jiao HU,Xiufan LIU.  Frontiers of Agricultural Science and Engineering. 2016(01)
[3]Advances in NF-κB Signaling Transduction and Transcription[J]. Weihua Xiao~1 1 University of Science and Technology of China,China.2 Laboratory of Molecular Immunoregulation,NCI-Frederick,Frederick.MD 21702.USA..  Cellular & Molecular Immunology. 2004(06)



本文编号：3498200