Novel-miR-3880对奶山羊乳腺上皮细胞功能和乳腺发育的调控作用研究
发布时间：2022-01-09 11:19
乳腺是哺乳动物特有的可泌乳的分泌型器官,乳腺上皮细胞是体外研究乳腺生理功能的重要模型,是体内泌乳系统细胞的典型代表。泌乳性状作为奶山羊重要的性状之一,研究乳汁主要成分乳蛋白和乳脂形成的分子机制可为奶山羊分子育种提供理论依据,加快育种进程。MiRNA是一类多靶点的非编码RNA,通过种子位点与靶基因结合,对靶基因进行转录后调控,继而参与多种生物进程。MiRNA在不同泌乳时期的差异表达显示miRNA在调节泌乳性状方面发挥重要作用。本课题组前期研究显示奶山羊乳腺中novel-miR-3880在奶山羊泌乳高峰期的表达量较高,有报道指出泌乳高峰期乳腺中代谢速率明显加快,底物摄取增加,蛋白和脂质合成增多,由此推测novel-miR-3880在乳腺发育和乳合成中发挥调节作用。环状RNA是一类可变剪切产生的共价闭环非编码RNA,有多个miRNA结合位点,可作为miRNA分子海绵与miRNA靶基因产生竞争性结合,从而减弱miRNA对靶基因的调节作用。然而,novel-miR-3880和环状RNA在奶山羊泌乳分子机制方面研究较少。本课题组前期通过高通量测序建立了奶山羊环状RNA数据库,通过生物信息学分析,预...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
乳腺泌乳过程
织差异表达检测。2.2.2.2小鼠活体试验及样品采集选取年龄、体重、胎次、仔鼠数和仔鼠重相近的同一天产仔的小鼠18只，分为3组，每组6只，饲养于SPF环境中，提供自由饮食和自由饮水，正常哺乳，产后第3天开始注射处理以免引起应激过大导致小鼠死亡，试验过程每窝小鼠分笼饲养，保证其生存环境，并每天更换垫料、水和食物。合成的novel-miR-3880agomir和ELF2siRNA（siELF2）用生理盐水稀释，对照组注射等量的生理盐水，试验组以10nmol/次/只的剂量注射，间隔3天或4天注射一次，第22天收集母鼠乳腺组织和血样，试验过程概要如图2-1所示。图2-1小鼠处理示意图Figure2-1Schematicdiagramofmicetreatment2.2.3细胞培养参照Wang等(Wang,Luoetal.2010)的方法分离纯化奶山羊乳腺上皮细胞并采用免疫荧光技术进行鉴定。纯化好的细胞在细胞培养液中培养，细胞培养液配方为DMEM/F12基础培养基，10%的胎牛血清和双抗。细胞传代时弃去培养液，用PBS冲洗细胞三次后加入胰蛋白酶细胞消化液，待细胞变圆时用细胞培养液终止消化，并轻轻吹打成均匀的细胞悬液，一分为二，继续置于37℃CO2细胞培养箱内培养，培养箱内保持湿润环境。2.2.4细胞小RNA转染本研究所有的小RNA序列见附录三。按照LipofectamineRNAiMAXReagent（Invitrogen）转染试剂说明书转染细胞，转染试剂的体积为小RNA体积的三倍，分别加入无血清培养基中配置好后将小RNA溶液加入转染试剂溶液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟，加入细胞中摇匀即可。2.2.5转录组生物信息学分析2.2.5.1RNA提取按照Trizol试剂说明书提取RNA，具体步骤见附录四，提取的RNA用于转录组测序或RT-qPCR，转录组测序中RNA质量用Agilentbioanalyzer2100芯片生物分析
第二章山羊novel-miR-3880下游差异基因的筛选及其对乳腺发育的调控作用23图2-2Novel-miR-3880差异基因筛选及验证Figure2-2Screeninganddetectionofdifferentiallyexpressedgenes（DEGs）ofnovel-miR-3880（a）Novel-miR-3880差异基因在火山图中的显示；（b）Novel-miR-3880差异基因数量；（c）测序结果中10个差异基因实时定量PCR验证（a）Novel-miR-3880DEGsinvolcanoplot；（b）Numberofnovel-miR-3880DEGs；（c）RT-qPCRdetectionof10DEGs2.3.2Novel-miR-3880下游差异基因GO富集分析对获得的67个差异基因进行GO注释，并以参与的生物过程、基因的分子功能和细胞组分进行基因功能分类，富集结果显示novel-miR-3880参与23个细胞代谢途径，包括8个生物进程相关代谢途径、5个分子功能相关代谢途径和10个细胞组分相关代谢途径（图2-3）。其中富集下游差异基因最多的代谢进程集中在生物进程，包括免疫系统进程（GO:0002376）、应激反应（GO:0050896）、细胞进程（GO:0009987）和单有机体代谢进程（GO:0008152）等。
本文编号：3578617
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
乳腺泌乳过程
织差异表达检测。2.2.2.2小鼠活体试验及样品采集选取年龄、体重、胎次、仔鼠数和仔鼠重相近的同一天产仔的小鼠18只，分为3组，每组6只，饲养于SPF环境中，提供自由饮食和自由饮水，正常哺乳，产后第3天开始注射处理以免引起应激过大导致小鼠死亡，试验过程每窝小鼠分笼饲养，保证其生存环境，并每天更换垫料、水和食物。合成的novel-miR-3880agomir和ELF2siRNA（siELF2）用生理盐水稀释，对照组注射等量的生理盐水，试验组以10nmol/次/只的剂量注射，间隔3天或4天注射一次，第22天收集母鼠乳腺组织和血样，试验过程概要如图2-1所示。图2-1小鼠处理示意图Figure2-1Schematicdiagramofmicetreatment2.2.3细胞培养参照Wang等(Wang,Luoetal.2010)的方法分离纯化奶山羊乳腺上皮细胞并采用免疫荧光技术进行鉴定。纯化好的细胞在细胞培养液中培养，细胞培养液配方为DMEM/F12基础培养基，10%的胎牛血清和双抗。细胞传代时弃去培养液，用PBS冲洗细胞三次后加入胰蛋白酶细胞消化液，待细胞变圆时用细胞培养液终止消化，并轻轻吹打成均匀的细胞悬液，一分为二，继续置于37℃CO2细胞培养箱内培养，培养箱内保持湿润环境。2.2.4细胞小RNA转染本研究所有的小RNA序列见附录三。按照LipofectamineRNAiMAXReagent（Invitrogen）转染试剂说明书转染细胞，转染试剂的体积为小RNA体积的三倍，分别加入无血清培养基中配置好后将小RNA溶液加入转染试剂溶液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟，加入细胞中摇匀即可。2.2.5转录组生物信息学分析2.2.5.1RNA提取按照Trizol试剂说明书提取RNA，具体步骤见附录四，提取的RNA用于转录组测序或RT-qPCR，转录组测序中RNA质量用Agilentbioanalyzer2100芯片生物分析
第二章山羊novel-miR-3880下游差异基因的筛选及其对乳腺发育的调控作用23图2-2Novel-miR-3880差异基因筛选及验证Figure2-2Screeninganddetectionofdifferentiallyexpressedgenes（DEGs）ofnovel-miR-3880（a）Novel-miR-3880差异基因在火山图中的显示；（b）Novel-miR-3880差异基因数量；（c）测序结果中10个差异基因实时定量PCR验证（a）Novel-miR-3880DEGsinvolcanoplot；（b）Numberofnovel-miR-3880DEGs；（c）RT-qPCRdetectionof10DEGs2.3.2Novel-miR-3880下游差异基因GO富集分析对获得的67个差异基因进行GO注释，并以参与的生物过程、基因的分子功能和细胞组分进行基因功能分类，富集结果显示novel-miR-3880参与23个细胞代谢途径，包括8个生物进程相关代谢途径、5个分子功能相关代谢途径和10个细胞组分相关代谢途径（图2-3）。其中富集下游差异基因最多的代谢进程集中在生物进程，包括免疫系统进程（GO:0002376）、应激反应（GO:0050896）、细胞进程（GO:0009987）和单有机体代谢进程（GO:0008152）等。
本文编号：3578617
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