转基因水稻检测方法与标准物质研究

发布时间：2022-01-20 22:18

　　转基因水稻的研发技术日益成熟,越来越多的转化体获得不同国家的安全许可或进入田间试验,但作为重要主粮,其产业化及安全性问题引起社会广泛关注,近年来,有关转基因水稻的突发事件时有发生,引起了不必要的贸易摩擦和民众恐慌,国内外都高度重视转基因水稻的安全评价与监管检测工作。因此,加强转基因水稻检测方法与标准物质的研究,提升监管能力水平十分必要。本研究首先针对基于硅基质膜柱的基因组DNA提取方法进行优化,开发了新型植物种子基因组DNA提取试剂盒,同时对水稻种子研磨粒度与基因组DNA提取质量之间关系进行分析,提高基因组DNA质量和得率,为下一步PCR检测提供基础;其次对已发现的和本研究开发的水稻内标准基因,以及反应体系与程序进行优化筛选、深入研究,研制了水稻内标准基因检测方法标准;再次对转基因水稻的筛选元件进行统计分析,建立了转基因水稻筛查检测方法,构建了检测用阳性标准质粒;最后成功研制了转基因抗虫水稻克螟稻基因组DNA标准物质,为检测提供物质基础。这些结果为我国转基因水稻安全评价与管理、标识制度的实施,以及监管检测提供了数据基础和技术支撑。本研究我们取得的主要成果如下:1.研发了一种新型植物种子... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：152 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

转基因产品PCR检测策略示意图及特异性情况

吉林大学博士学位论文18混合机、水分测定仪等，且对设备和操作环境的要求也比较高，因此生产成本较昂贵[131,132]。3.1.2质粒DNA标准物质质粒标准物质（plasmidreferencematerial）是指由含有转基因检测外源目的基因和内标准基因特异性片段的重组质粒分子制备形成的标准物质[133]。它的优点有可以通过微生物培养而无限复制，制备过程相对简单，不需要复杂的仪器设备，对制备操作环境要求不高，生产成本较低；质粒标准物质不需要再抽提DNA，使用方便，且均匀性好、纯度高；可以实现高通量检测，因为一个质粒标准分子可以包含多个转基因转化体的外源目的片段，可以同时对多个转化体进行检测[134-136]。缺点是只能用于基于核酸的检测方法；质粒分子的DNA与待测样品的基因组DNA的基质差异，可能会导致两者的PCR扩增效率不一致，进而导致定量结果的误差，因此测定结果需要校正系数（CoefficientValues,CVs）来校正；对于温度、浓度、时间等储存条件较敏感，相对不稳定[137]。3.1.3基因组DNA标准物质基因组DNA标准物质是一类来自于转基因和非转基因植物叶片基因组DNA，用于转基因植物定性和定量检测的标准物质。基因组DNA标准物质其特点是相对于其它标准物质如基体标准物质来说制备容易；在定量检测过程中不需要额外的校正系数。缺点是对原材料要求严格，很多品系因没有批准商业化，原材料供给有限；而且它需要提取大量的DNA，耗费大量的人力。图2转基因检测标准物质量值转化应用示意图Fig.2StrategydiagramofGMOPCRdetectionandthedetectionspecificity

吉林大学博士学位论文28（7）弃上清，加入500μL，5mL、5mL70％乙醇溶液洗涤，12000r/min离心10min。（8）弃上清，将离心管倒立于吸水纸吸干，并使乙醇充分挥发，干燥DNA；加50μL水溶解DNA。DNA溶液-20℃保存备用。1.2.11不同水稻种子粒度对DNA提取质量的影响本实验中，我们采用了改良CTAB法、Qiagen、Tiangen试剂盒三种提取方法来提取不同粒度水稻种子DNA。分别用电泳法和紫外分光光度计法，测定DNA的质量。1.3实验结果1.3.1过柱缓冲液pH值优化结果过柱缓冲液pH值分别为4.0，4.5,5.0,5.5,6.0,6.5和7.0时，玉米、水稻、棉花和大豆种子的DNA提取得率见图3至图6可得，过柱缓冲液pH值为5.0-6.0时，DNA得率较高、质量较好，其中，当过柱缓冲液pH值为5.5时,DNA得率不仅远远高于其它pH的得率，而且DNA的纯度也最高。因此，为了达到更好的效果，过柱缓冲液pH值优选为5.5。图3过柱缓冲液不同pH值下玉米种子的DNA得率Fig.3DNAyieldofmaizeseedsatdifferentpHvaluesincolumn-crossingbuffer图4过柱缓冲液不同pH值下水稻种子的DNA得率Fig.4DNAyieldofriceseedsatdifferentpHvaluesincolumn-crossingbuffer

【参考文献】：
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本文编号：3599620