TGEV诱导肠上皮细胞间质化促进ETEC K88的粘附

发布时间：2022-10-28 22:43

　　仔猪腹泻是养猪业的一种常见多发病,该病给我国和世界养猪业造成巨大的经济损失。流行病学调查显示,仔猪腹泻通常是多种病原体混合感染引起的。尽管近年来有关肠道病原体混合感染的报道不少,但病原体混合感染、发挥生物协同作用、加重腹泻的作用机制知之甚少。猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic coli K88,ETEC K88）是引起仔猪腹泻的主要病原,临床中已出现二者混合感染且加重仔猪腹泻的疫情。因此研究TGEV与ETEC K88的共感染机制势在必行。本研究首先利用猪小肠上皮细胞（Intestinal porcine epithelial cells,IPEC-J2）作为体外感染细胞模型,分别用 TGEV、ETEC K88 和 TGEV-ETEC K88 感染 IPEC-J2 细胞,对 TGEV 和 ETEC K88 之间的相互影响及细胞的蛋白组学进行分析。接着,我们探究TGEV感染后促进ETEC K88对肠上皮细胞粘附的机制,对TGEV如何诱导肠上皮细胞发生上皮间质转化（epith... 

【文章页数】：143 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语中英文对照
绪论
第一篇 文献综述
    第一章 仔猪腹泻的研究进展
        1 仔猪腹泻的发病原因
        2 混合感染
        3 混合感染机制
            3.1 破坏上皮细胞完整性
            3.2 增加病原体粘附的受体
            3.3 破坏宿主的先天免疫反应
            3.4 病毒感染为细菌增殖提供营养物质
        4 猪传染性胃肠炎病毒和产肠毒素大肠杆菌
        参考文献
    第二章 上皮细胞间质转化的研究进展
        1 上皮细胞间质化概述
        2 引起上皮细胞间质化的转录因子
        3 TGF-B诱导上皮细胞间质化的信号通路
            3.1 TGF-β通过smads诱导上皮细胞间质化
            3.2 TGF-β通过非smads诱导上皮细胞间质化
            3.3 其他调节上皮细胞间质化的信号通路
        4 诱导上皮细胞发生间质化的病原微生物
            4.1 脂多糖
            4.2 鞭毛蛋白和胞壁酰二肽
            4.3 幽门螺旋杆菌
            4.4 大肠杆菌
            4.5 爱泼斯坦-巴尔病毒
            4.6 肝炎病毒
        参考文献
第二篇 试验部分
    第三章 TGEV和ETEC K88共感染猪小肠上皮细胞后蛋白组学分析
        1 试验材料
            1.1 细胞、毒株和菌株
            1.2 试剂
            1.3 主要设备
            1.4 主要溶液配制
        2 试验方法
            2.1 TGEV和ETEC K88共感染肠上皮细胞的试验设计
            2.2 ETEC K88体外粘附肠上皮细胞
            2.3 ETEC K88影响TGEV在肠上皮细胞中的复制
                2.3.1 qPCR检测TGEV N基mRNA表达
                2.3.2 Western blot检测TGEVN蛋白的表达
            2.4 qPCR检测细胞因子的表达
            2.5 TGEV和ETEC K88共感染肠上皮细胞蛋白组学分析
                2.5.1 提取细胞蛋白、消化蛋白及iTRAQ试剂盒标记肽段
                2.5.2 肽段初步分离
                2.5.3 液相色谱串联质谱分析
                2.5.4 蛋白定量和鉴定
                2.5.5 差异蛋白的GO分析
            2.6 验证integrin α5在TGEV促进ETEC K88粘附中的作用
                2.6.1 qPCR、western blot和流式细胞术检测integrin α5的表达
                2.6.2 Integrinα5影响ETEC K88的粘附
            2.7 数据分析
        3 试验结果
            3.1 TGEV促进ETEC K88对肠上皮细胞的粘附
            3.2 ETECK88抑制TGEV在肠上皮细胞的复制
            3.3 TGEV和ETEC K88影响炎性细胞因子的产生
            3.4 TGEV和ETEC K88感染肠上皮细胞后差异蛋白的GO分析
            3.5 Integrin α5影响ETEC K88对肠上皮细胞的粘附
        4 讨论
        参考文献
    第四章 TGEV持续感染通过诱导肠上皮细胞间质化促进ETEC K88的粘附
        1 试验材料
            1.1 细胞、毒株和菌株
            1.2 试剂
            1.3 主要设备
            1.4 主要溶液配制
        2 试验方法
            2.1 TGEV持续感染肠上皮细胞
                2.1.1 TGEV体外持续感染肠上皮细胞
                2.1.2 流式细胞仪检测感染TGEV阳性细胞比例
                2.1.3 qPCR检测TGEVN基因的表达
                2.1.4 蚀斑试验检测细胞上清中TGEV的释放量
            2.2 TGEV诱导肠上皮细胞发生间质化
                2.2.1 TGF-β诱导肠上皮细胞发生间质化
                2.2.2 qPCR检测间质细胞标志基因的表达
                2.2.3 Western blot检测上皮细胞间质化标志蛋白的表达
                2.2.4 免疫荧光检测vimentin和twist的表达
            2.3 TGEV持续感染改变肠上皮细胞的细胞特性
                2.3.1 细胞与细胞外基质的粘附能力的变化
                2.3.2 细胞的迁移和侵袭能力的变化
                2.3.3 细胞吞噬能力的变化
            2.4 qPCR检测细胞因子的表达
            2.5 TGEV诱导肠上皮细胞发生间质化的信号通路
            2.6 TGF-β参与调控ETEC K88对肠上皮细胞的粘附
            2.7 数据分析
        3 试验结果
            3.1 TGEV持续感染肠上皮细胞
            3.2 TGEV持续感染诱导肠上皮细胞发生间质化
                3.2.1 TGEV持续感染改变肠上皮细胞形态
                3.2.2 TGEV持续感染诱导间质细胞标志基因的表达
                3.2.3 TGEV持续感染诱导上皮细胞间质化标志蛋白的表达
                3.2.4 TGEV持续感染促进vimentin和twist的表达
            3.3 TGEV持续感染改变肠上皮细胞的细胞特性
                3.3.1 TGEV持续感染降低细胞与细胞外基质的粘附
                3.3.2 TGEV持续感染提高细胞的迁移与侵袭能力
                3.3.3 TGEV持续感染增加细胞的吞噬能力
            3.4 TGEV持续感染促进炎性细胞因子的表达
            3.5 TGF-β、PI3K/AKT和ERK信号通路参与调节TGEV诱导的肠上皮细胞间质化
            3.6 TGF-β参与调控ETEC K88对肠上皮细胞的粘附
        4 讨论
        参考文献
    第五章 TGEV感染后耐过仔猪小肠的变化
        1 试验材料
            1.1 试验动物
            1.2 试剂
            1.3 主要设备
            1.4 主要溶液配制
        2 试验方法
            2.1 动物试验设计
            2.2 Western blot检测小肠E-cadherin、vimentin、integrin α5和fibronectin的表达
            2.3 HE染色检测小肠病理学变化
            2.4 免疫组化检测小肠免疫细胞变化
            2.5 免疫荧光检测树突状细胞的变化和肠上皮细胞的增殖情况
            2.6 qPCR检测炎性细胞因子的表达
            2.7 绝对荧光定量PCR检测肠道菌群
            2.8 数据分析
        3 试验结果
            3.1 TGEV持续感染耐过仔猪
            3.2 TGEV感染后耐过仔猪小肠发生间质化
            3.3 TGEV感染后耐过仔猪小肠病理学变化
            3.4 TGEV感染后耐过仔猪小肠免疫细胞的变化
            3.5 TGEV感染后耐过仔猪小肠M细胞变化
            3.6 TGEV感染后耐过仔猪小肠上皮细胞的增殖情况
            3.7 TGEV影响仔猪小肠细胞因子mRNA的表达
            3.8 TGEV感染后对耐过仔猪肠道菌群的影响
        4 讨论
        参考文献
全文总结
本文创新点
附录
论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Using probiotics to improve swine gut health and nutrient utilization[J]. Shengfa F.Liao,Martin Nyachoti.  Animal Nutrition. 2017(04)
[2]Effects of casein glycomacropeptide supplementation on growth performance,intestinal morphology, intestinal barrier permeability and inflammatory responses in Escherichia coli K88 challenged piglets[J]. Yili Rong,Zeqing Lu,Haiwen Zhang,Lin Zhang,Deguang Song,Yizhen Wang.  Animal Nutrition. 2015(02)
[3]新生仔猪黄痢与传染性胃肠炎混合感染的诊治[J]. 杨成权,许英民.  今日畜牧兽医. 2014(04)
[4]一例猪传染性胃肠炎病毒与大肠杆菌混合感染的实验室诊断[J]. 韩燕,代洪波,马定美,安德科,卢银化,朱玲.  中国猪业. 2012(02)
[5]新生仔猪传染性胃肠炎与黄白痢合并感染的治疗[J]. 黄新娟.  中国畜牧兽医文摘. 2011(03)
[6]Pathobiology of the neutrophil-intestinal epithelial cell interaction:Role in carcinogenesis[J]. Paul M Hofman.  World Journal of Gastroenterology. 2010(46)
[7]猪腹泻的病因分析与防治原则[J]. 陈志新.  畜牧与饲料科学. 2010(08)
[8]猪传染性胃肠炎病毒与大肠杆菌混合感染的诊治[J]. 黄小波,文心田,曹三杰,杨恒.  养猪. 2008(03)



本文编号：3697425