内质网应激和自噬在山羊黄体退化过程中的作用及机制

发布时间：2023-02-26 10:34

　　黄体是雌性哺乳动物卵巢中的暂时性分泌组织,由卵泡排卵后的泡膜细胞和颗粒细胞分化形成,其重要功能是分泌孕酮。黄体维持与退化与发情周期、生殖道发育以及妊娠维持和分娩密切相关。已经清楚,黄体退化主要是在前列腺素F2α(PGF2α)的作用下完成的,细胞凋亡的调控伴随着黄体的维持和退化进程。内质网作为合成和加工蛋白质、胆固醇的场所,是细胞重要的细胞器,内质网的稳态对于黄体的孕酮合成分泌功能十分重要,超负荷的蛋白堆积及Ca²⁺的失衡导致的内质网内环境紊乱被称为内质网应激(ER stress),内质网应激诱发未折叠蛋白反应(UPR),通过降低蛋白合成、促进蛋白的折叠、运输缓解内质网应激,使内质网重新恢复稳态,但当UPR不足以恢复内质网稳态时,则会启动细胞的凋亡。有研究证明,UPR还参与了自噬的调节,自噬也是影响细胞生存的因素之一。研究发现,在大鼠和牛退化时期的黄体中发生内质网应激,但未折叠蛋白反应信号通路的活化方式并不相同,提示未折叠蛋白反应参与调控黄体的退化,但在不同物种中的调控方式不同,且未折叠蛋白反应对黄体退化的调控机制尚不明确。另外,未折叠蛋白反应是否通过影响自噬从而参...

【文章页数】：97 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一部分 文献综述
    第一章 暂时性的分泌腺—黄体
        1.1 黄体的形成和功能
            1.1.1 形成黄体的主要细胞来源
            1.1.2 黄体的形成过程
            1.1.3 黄体的功能及其调控机制
        1.2 黄体的退化
            1.2.1 PGF2α的产生和作用
            1.2.2 PGF2α引起的黄体功能性退化
            1.2.3 PGF2α引起的黄体结构性退化
    第二章 内质网应激和自噬与凋亡的调控作用
        2.1 内质网及其内环境稳态的调控机制
            2.1.1 内质网功能
            2.1.2 内质网应激及其调控机制
            2.1.3 内质网应激介导的细胞凋亡
        2.2 自噬
            2.2.1 自噬的发生及其调控机制
            2.2.3 内质网应激、自噬和凋亡之间的相互影响
第二部分 试验研究
    第三章 未折叠蛋白反应和自噬在山羊卵巢中的活化规律
        3.1 材料
            3.1.1 组织
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 主要仪器
        3.2 方法
            3.2.1 山羊卵巢组织的收集和黄体的分离
            3.2.2 免疫组化法检测GRP78在山羊卵巢中的表达定位
            3.2.3 不同时期黄体的鉴定
            3.2.4 Western blot检测不同时期山羊黄体中内质网应激、自噬、凋亡相关蛋白的表达变化
        3.3 结果与分析
            3.3.1 山羊卵巢中GRP78的表达定位
            3.3.2 不同时期山羊黄体的鉴定
            3.3.3 内质网应激相关基因在山羊不同时期黄体中的表达规律
            3.3.4 自噬相关基因在山羊不同时期黄体中的表达规律
            3.3.5 凋亡相关基因在山羊不同时期黄体中的表达规律
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 内质网应激和自噬在PGF2α诱导山羊黄体细胞凋亡过程中的作用
        4.1 材料
            4.1.1 细胞
            4.1.2 主要试剂
            4.1.3 主要仪器
        4.2 方法
            4.2.1 永生化山羊黄体细胞系的复苏、传代和冻存
            4.2.2 山羊黄体细胞凋亡模型的构建
            4.2.3 检测PGF2α对山羊黄体细胞内质网应激、自噬水平的影响
            4.2.4 检测内质网应激、自噬在调控山羊黄体细胞凋亡过程中的作用
        4.3 结果与分析
            4.3.1 PGF2α浓度的筛选
            4.3.2 PGF2α对山羊黄体细胞凋亡的影响
            4.3.3 PGF2α对山羊黄体细胞内质网应激、自噬的影响
            4.3.4 改变内质网应激状态对黄体细胞凋亡的影响
            4.3.5 内质网应激对山羊黄体细胞线粒体凋亡信号通路的影响
            4.3.6 CQ对PGF2α诱导的山羊黄体细胞凋亡的影响
            4.3.7 4-PBA和CQ对 PGF2α引起的山羊黄体细胞内质网应激和自噬的影响
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 未折叠蛋白反应调控山羊黄体细胞凋亡过程的作用机制
        5.1 材料
            5.1.1 细胞
            5.1.2 质粒
            5.1.1 主要试剂
            5.1.2 主要仪器
        5.2 方法
            5.2.1 山羊EIF2S1基因shRNA慢病毒载体的构建
            5.2.2 慢病毒包装和浓缩
            5.2.3 慢病毒感染山羊黄体细胞及干扰效率的检测
            5.2.4 敲低EIF2S1表达对PGF2α诱导黄体细胞凋亡的影响
            5.2.5 山羊ATF6、IRE1基因siRNA转染黄体细胞及干扰效率的检测
            5.2.6 敲低ATF6、IRE1表达对PGF2α诱导黄体细胞凋亡的影响
        5.3 结果与分析
            5.3.1 重组载体pCD513B-U6-shEIF2S1的鉴定
            5.3.2 包装慢病毒所需的辅助质粒鉴定
            5.3.3 转染效率的鉴定
            5.3.4 慢病毒滴度测定
            5.3.5 针对EIF2S1基因的慢病毒干扰效率检测及有效片段的筛选
            5.3.6 干扰EIF2S1 基因的表达对PGF2α诱导的黄体细胞凋亡的影响
            5.3.7 干扰EIF2S1对PGF2α引起的黄体细胞内质网应激和自噬的影响
            5.3.8 siATF6干扰效率的检测及有效片段的筛选
            5.3.9 干扰ATF6对PGF2α引起的黄体细胞内质网应激、自噬的影响
            5.3.10 干扰ATF6 基因的表达对PGF2α诱导的黄体细胞凋亡的影响
            5.3.11 siIRE1干扰效率的检测及有效片段的筛选
            5.3.12 干扰IRE1对PGF2α引起的黄体细胞内质网应激和自噬的影响
            5.3.13 干扰IRE1 基因的表达对PGF2α诱导的黄体细胞凋亡的影响
            5.3.14 干扰IRE1基因的表达对黄体细胞线粒体凋亡信号通路的影响
        5.4 讨论
        5.5 小结
结论
创新点和不足
参考文献
缩略词
致谢
作者简介



本文编号：3750359