猪抗蓝耳

发布时间：2017-05-18 21:03

  本文关键词：猪抗蓝耳病、圆环病毒病相关基因的鉴定与功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪病已成为当前制约养猪业健康发展的关键因素之一,其中猪蓝耳病和圆环病毒病为危害世界养猪生产的两大重要的疫病。PRRSV和PCV2都是能导致猪繁殖障碍的主要病原,此外,造成猪的免疫抑制,引起其他病原微生物的继发或并发感染,给世界的养猪业造成了巨大的经济损失。猪的遗传学组成能够影响宿主对病毒的易感。研究表明,不同的猪种间对PRRSV和PCV2相关疾病的易感性存在差异是由于宿主遗传差异导致的。本研究首先对与PRRSV抗性相关的两个候选基因USP18和Mx1进行了启动子区功能分析,然后在实验条件下,研究遗传背景不同的莱芜猪和大长杂交商品猪对PCV2易感是否存在差异以及探讨抗性或易感差异的分子机制,寻找与猪抗PPRSV和PCV2有关的分子标记。主要的研究结果如下:1.本研究对比了中国地方猪种大蒲莲猪和杜-大-长杂交商品猪USP18基因启动子区活性,以及筛选了单核苷酸多态性对USP18转录的影响。我们发现大蒲莲猪的启动子活性明显高于杜-大-长杂交商品猪(P0.05);启动子删除试验中,当启动子从-1790删除到-1314时,其转录活性下降约60%(P0.05);同时MARC-145细胞感染PRRSV前后,在此区段的单核苷酸多态位点G 1533A均能提高USP18基因mRNA的表达。群体遗传学分析结果显示等位基因A只存在于对PRRSV抗性更强的中国猪种中。这些结果表明猪USP18基因启动子区的单核苷酸多态位点G 1533A多态性是抗PRRSV的一个潜在的DNA分子标记。2.猪Mx1基因启动子区的-2713到-2565和-688到-431两个区域存在顺式作用元件。通过对扩增的猪Mx1基因启动子区进行测序和比对,发现在-547位点发现了一个275bp的短散布重复元件(SINE)。等位基因B(有275bp的插入)主要存在于中国地方猪种中,而在西方瘦肉品种中频率很低。分别将含有和不含275bp片段插入的启动子通过瞬时转染MARC-145细胞,比较其荧光素酶活性。结果显示不论是在感染猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)前还是感染后,275bp片段的插入均显著提高了荧光素酶的活性(P0.05)。这些结果表明Mx1基因启动子区-547位点的SINE插入多态性是一个潜在的抗PRRSV的DNA分子标记。3.随机采样6周龄的15头莱芜猪和15头大长杂交商品猪。所有的猪只PCV1,PCV2,PRRSV和PPV抗原抗体检测为阴性。随机分成四组,莱芜猪和大长杂交商品猪攻毒组各10头,对照组各5头。攻毒组肌肉注射3ml(103.8tcid50/ml)的pcv2-sd毒株,对照组接种等量的磷酸盐缓冲液。攻毒当天被记为0d。攻毒后每天测量体温,观察临床症状,分别在0d、4d、7d、10d、14d、21d、28d、35d称重、采集血液,利用pcr及绝对定量pcr对血清中的pcv2dna病毒拷贝数及细胞因子的变化(il-1β、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、il-12、gm-csf、ifn-γ、tgf-β1和tnfα)进行分析,elisa试剂盒检测igg的变化。35d剖杀时采集肺脏、扁桃体、胸腺、回肠、脾脏、肝脏和淋巴结等组织,10%福尔马林溶液固定,制作组织切片,he染色观察病理变化。结果表明:从攻毒的0d到35d,攻毒组莱芜猪与攻毒组商品猪相比,60%(6/10)的商品猪出现了猪断奶后多系统衰竭综合征的典型临床症状,例如食欲下降,咳嗽,拉稀和渐进性消瘦,偶尔打喷嚏;攻毒14d后,商品猪最显著的症状是皮肤上出现圆形或形状不规则的红紫斑和丘疹,主要是在背部和后退部位。大约一半的商品猪攻毒后14d到28d间出现了呼吸急促。莱芜猪未出现明显的临床症状,只出现轻微的厌食,咳嗽和发热等症状。与对照组相比,商品猪从攻毒后的第10d开始直肠温度高于40℃一直持续到14d。莱芜猪体温变化不显著。与对照组比,在整个攻毒期间莱芜猪的体重无显著变化,而商品猪在攻毒后21d到35d之间平均体重明显低于对照组。大长杂交商品猪的肺脏出现不同程度的肺充血,严重病例肺泡出血,肺小叶间质明显增宽,出血严重,支气管处出现大量淋巴细胞浸润。肝脏为轻度到中度的肝萎缩,花斑肝,被膜下淋巴细胞大量减少,而莱芜猪攻毒后未出现此类临床症状。莱芜猪与大长猪的igg总含量在感染pcv2期间没有出现显著差异,但是莱芜猪igg的总含量高于大长猪的总含量。在感染pcv2的早期,莱芜猪血清中il-6(p0.01)、il-4、il-8和tgf-β1水平均显著上升(p0.05),大长杂交猪血清中的炎性细胞因子tnf-α的蛋白水平显著上升(p0.05),趋化因子il-8的表达量持续下降,调节细胞因子il-10表达水平后期突然显著升高(p0.05),综合分析上述细胞因子的表达动态表明,pcv2感染后大长杂交猪出现急性炎症反应,导致猪早期抗病毒能力和趋化功能降低,使大长杂交猪的免疫调节机能出现抑制和紊乱。大长杂交商品猪血清中的pcv2dna病毒的拷贝数均高于莱芜猪,且在攻毒后第35d达到了显著性差异(p0.05)。4.利用rna-seq技术分析了莱芜猪和大长杂交商品猪感染pcv2后肺脏组织的差异基因表达的情况,两个品种共找出了374个差异表达基因,莱芜猪攻毒组与对照组相比,有83个上调基因和86个下调基因;商品猪中187个上调基因,18个下调基因。在这些差异表达基因中,两个猪种中5个共同上调基因和4个下调基因。对差异表达基因进行GO功能注释发现大长杂交商品猪中有150、160和156个基因被注释到生物学过程、细胞组分和分子功能的条目中;莱芜猪有149、134和134个基因被分别注释相应的三个条目中。374个差异表达基因被注释到了KEGG数据库中的299条通路中,每条通路中的差异表达基因从1到25个不等。其中具有代表性的通路是补体和凝血级联通路、RIG-I-like受体信号通路和B细胞受体通路。定量PCR结果显示,补体凝血级联通路中的肺组织的损伤有关的4个基因(TFPI、SERPINC1、SERPINA1和SERPINA5)均在攻毒的莱芜猪中显著表达上调,而在大长杂交商品猪中的无明显表达变化。通过对表达谱数据的分析,初步筛选出导致PCV2感染产生不同的肺部病变的差异表达基因。综上所述,本实验首先对与PRRSV抗性相关的两个基因USP18和Mx1进行了启动子区多态分析,结果表明猪USP18基因启动子区的单核苷酸多态位点G 1533A多态性和Mx1基因启动子区-547位点的SINE插入多态性均可以作为潜在的抗PRRSV的DNA分子标记。然后对地方猪种和杂交商品猪感染PCV2抗性或易感性是否存在差异以及存在此差异的分子机制进行了探讨。结果显示,莱芜猪和大长杂交商品猪对PCV2感染的生物学反应有所不同,二者在感染PCV2后肺组织中基因的表达也具有较大差异。定量PCR验证分析了凝血通路中的与肺损伤相关的4个基因(TFPI、SERPINC1、SERPINA1和SERPINA5),证明PCV2感染后这4个基因在攻毒后的莱芜猪和大长杂交商品猪的肺组织中的mRNA表达水平存在差异。本研究寻找到了与大长杂交商品猪感染PCV2后出现严重肺组织病变的相关易感基因,为进一步探讨猪PCV2的发病机制和得到与抗PCV2有关的DNA分子标记奠定基础。
【关键词】：猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪圆环病毒 数字基因表达谱 细胞因子 差异表达基因 丝氨酸蛋白酶抑制子A1
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 符号说明5-10
• 中文摘要10-13
• Abstract13-18
• 1 前言18-38
• 1.1 猪蓝耳病的相关研究进展18-21
• 1.1.1 猪对PRRSV感染存在抗性差异18-19
• 1.1.2 USP18基因的研究现状19-20
• 1.1.3 Mx1基因的研究现状20-21
• 1.2 猪圆环病毒的研究进展21-33
• 1.2.1 猪圆环病毒基因组和分类22-23
• 1.2.2 猪圆环病毒的起源和演化23-24
• 1.2.3 猪圆环病毒的流行现状24-27
• 1.2.4 临床疾病27-29
• 1.2.5 PCV2发病机制29-32
• 1.2.6 在PCV2发病机制中细胞因子的作用32-33
• 1.3 RNA-seq技术33-35
• 1.4 SERPINA1基因的研究现状35-36
• 1.5 本研究的目的及意义36-38
• 2 材料与方法38-69
• 2.1 试验材料38-42
• 2.1.1 试验动物及攻毒38
• 2.1.2 样品采集38
• 2.1.3 毒株38
• 2.1.4 菌株及载体38
• 2.1.5 主要实验仪器和设备38-39
• 2.1.6 主要试剂和试剂盒及来源39-40
• 2.1.7 常用试剂的配制40-41
• 2.1.8 主要数据库和生物学软件41-42
• 2.2 实验方法42-69
• 2.2.1 猪基因组DNA的提取42
• 2.2.2 总RNA的提取及检测42-44
• 2.2.3 质粒DNA的提取（Tiangen试剂盒）44
• 2.2.4 凝胶回收PCR产物44-45
• 2.2.5 USP18和Mx1基因 5'调控区分析45-52
• 2.2.6 猪对PCV2感染的生物学反应52-61
• 2.2.7 RNA-seq分析肺组织差异表达基因61-69
• 2.2.8 统计分析69
• 3 结果与分析69-104
• 3.1 USP18基因 5'调控区多态性分析69-73
• 3.1.1 大蒲莲猪和大长杂交商品猪启动子活性比较69-70
• 3.1.2 USP18基因启动子删除载体双荧光素酶活性分析70-71
• 3.1.3 USP18基因启动子区突变对PRRSV感染的影响71-72
• 3.1.4 不同品种中G 1533A位点的多态性分析72-73
• 3.2 Mx1基因 5'调控区多态分析73-76
• 3.2.1 Mx1基因 5'调控区扩增及载体构建73-74
• 3.2.2 Mx1基因启动子区删除载体荧光素酶活性比较74-75
• 3.2.3 PRRSV感染对Mx1基因不同载体启动子活性影响75
• 3.2.4 不同猪种中?547位点多态性的群体检测75-76
• 3.3 不同品种猪对PCV2感染的生物学反应76-87
• 3.3.1 莱芜猪和大长杂交商品猪对感染PCV2后的临床症状比较76-77
• 3.3.2 莱芜猪和大长杂交商品猪体温体重变化77-78
• 3.3.3 剖检病变78-79
• 3.3.4 PCV2感染 35d时莱芜猪和大长杂交商品猪肺脏和脾脏的病理变化79-80
• 3.3.5 PCV2感染对免疫球蛋白IgG的影响80-82
• 3.3.6 PCR测定莱芜猪和大长杂交商品猪血清中PCV2病毒的含量82-83
• 3.3.7 莱芜猪和大长杂交商品猪感染PCV2后血清中病毒拷贝数变化83-85
• 3.3.8 PCV2感染不同时期猪细胞因子蛋白水平表达的变化85-87
• 3.4 莱芜猪和大长杂交商品猪肺组织差异表达基因的筛选87-104
• 3.4.1 总RNA质量检测87-88
• 3.4.2 表达谱测序及生物信息学分析88-94
• 3.4.3 差异表达基因的筛选94-96
• 3.4.4 差异表达基因的GO功能注释结果96-99
• 3.4.5 差异基因KEGG分析99-101
• 3.4.6 差异表达基因的定量PCR检测101-104
• 4 讨论104-111
• 4.1 与PRRSV抗性相关的两个基因启动子区多态性分析104-106
• 4.1.1 USP18基因启动子区多态性分析104-105
• 4.1.2 Mx1基因启动子区多态性分析105-106
• 4.2 莱芜猪和大长杂交商品猪对PCV2感染的临床症状106-107
• 4.3 PCV2感染后血清中细胞因子蛋白水平的动态变化107-109
• 4.4 差异表达基因的筛选与鉴定109-111
• 5 结论111-112
• 参考 文献112-126
• 致谢126-127
• 附录127-129
• 博士期间发表论文和专利情况129-130

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