植物MAPK级联途径基因家族的进化分析及番茄SlMPK13的功能鉴定

发布时间：2017-05-19 04:07

  本文关键词：植物MAPK级联途径基因家族的进化分析及番茄SlMPK13的功能鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPK)级联途径是存在于真核生物中的高度保守的信号转导途径之一。典型的MAPK级联途径由三种蛋白激酶组成,即MAPK (MPK)、MAPKK (MKK、MEK)和MAPKKK (MEKK),并通过MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化作用将信号传递放大。MAPK级联途径在植物生长发育及多种逆境响应中起重要作用。本研究从全基因组水平对两种重要蔬菜作物,番茄和黄瓜中的MAPK级联途径基因家族成员进行鉴定,并对它们的分类、保守结构域、基因结构、表达特征等进行了分析。同时利用生物信息学方法分析了MAPK级联途径相关基因家族在植物中的分布及进化关系。为进一步探究MAPK基因在番茄生长发育过程中的功能,在分离番茄雄蕊优势表达基因SIMPK13的基础上,我们进行了亚细胞定位、蛋白质体外原核表达、体外磷酸化活性以及表达特征分析。随后利用RNA干扰(RNAi)技术研究了SlMPK13在番茄营养生长、花器官形态发育及花粉发育中的功能,并利用RNA-seq技术探索了其在花粉发育中的作用机制。主要研究结果如下：(1)利用同源比对和HMMER搜索,在番茄基因组中共鉴定了89个MAPKKKs、5个MAPKKs和1个新的MAPK基因；在黄瓜基因组中共鉴定了59个MAPKKKs、6个MAPKKs和14个MAPKs。多序列比对、保守基序和系统进化分析结果表明,植物MAPK和MAPKK基因家族分为A、B、C、D四个亚组,而MAPKKK基因家族则分为MEKK、RAF和ZIK三个亚组。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析结果显示,多数番茄和黄瓜MAPK级联途径基因在多个植物器官中普遍表达,且参与多种逆境胁迫和激素的响应过程。(2)进化分析显示,MAPKKK家族的基因数目在不同植物中差异很大；植物MAPKKK家族在藻类植物进化以前就已完成三个亚族的分化；随着进化历程的演变,植物MAPKKK家族主要发生了两次基因数目的迅速扩增,分别发生在藻类植物到苔藓植物以及蕨类植物到开花植物的进化过程中,且植物MAPKKK基因数目的大量扩增主要发生在RAF亚族内。植物MAPKK家族A、B两个亚组的基因起源较早,在藻类植物中就已经存在；而C、D亚组MAPKK基因成员直到开花植物才出现。植物MAPK基因家族的迅速扩增发生在蕨类植物到开花植物的进化过程中,且主要发生在D亚组内；C、D两个亚组MAPK基因起源于藻类植物进化以前,A、B亚组的MAPK基因在苔藓植物中也已出现。(3) QRT-PCR及原位杂交结果表明,SlMPK13在番茄植株的多个器官/组织以及雄蕊的不同发育时期中都有表达,但在开放花的雄蕊中尤其是成熟花粉中优势表达。体外原核表达表明,SlMPK13编码一个大小约为44 kDa的水溶蛋白。将该蛋白与磷酸化的酪氨酸抗体进行Western杂交,结果显示其具有体外磷酸化的活性；亚细胞定位结果显示,SlMPK13定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。(4)构建了花椰菜花叶病毒CaMV35S组成型启动子启动的RNA干扰载体p35S::slmpkl3-RNAi,并利用“叶盘法”遗传转化番茄品种'Micro-Tom'。观察转基因后代发现,植株表现出生长矮小、叶片发育畸形、根发育受抑制、花器官异常肥大、雄蕊顶端开裂等多种表现型。以上结果表明,SlMPK13在番茄营养生长与生殖发育过程中的功能具有多效性。(5)为特异地研究SlMPK13在番茄花粉发育中的功能,我们构建了花粉特异启动子LAT52启动的RNAi载体pLAT52::slmpkl3-RNAi。对花粉进行表型观察发现,超过50%的转基因花粉畸形,花粉生活力及萌发率下降,花粉育性显著降低,番茄的座果率以及单果种子数目显著下降。花粉细胞学观察与DAPI染色结果显示,在小孢子发育的双核早期及其以前的几个时期,pLAT52::slmpkl3-RNAi转基因花粉发育正常,营养核及生殖核正常可见。双核大液泡时期以后,花粉细胞膜开始呈现不规则凹陷及破损,液泡数目增多。随着花粉成熟,液泡体积变大,细胞内容物逐渐降解,最终形成皱缩干瘪的花粉粒。(6)利用RNA-seq技术比较了pLAT52::slmpkl3-RNAi转基因与对照雄蕊在不同发育时期转录组基因表达的变化。结果发现,雄蕊发育早期差异表达基因数量极少,而雄蕊发育后期有1077个差异表达基因,其中846个上调表达,231个下调表达。基因本体论(Gene Othology, GO)和生物学代谢途径(pathway)分析显示,大多数差异表达基因参与“碳水化合物代谢”、“细胞元件形成”、“信号传导”、“细胞凋亡”等生物学过程。结合细胞学观察及亚细胞定位结果,我们推测,抑制SIMPK13的表达可能在花粉发育晚期启动了花粉细胞凋亡,使得细胞膜及液泡发育异常,细胞内碳水化合物或脂类代谢异常,从而影响成熟花粉的形成。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S641.2
【目录】：

• 致谢8-13
• 缩略词13-15
• 摘要15-17
• Abstract17-20
• 前言20-23
• 1 文献综述23-36
• 1.1 MAPK级联途径23-26
• 1.1.1 基本组成23
• 1.1.2 植物MAPKKK23-24
• 1.1.3 植物MAPKK24-25
• 1.1.4 植物MAPK25-26
• 1.2 植物MAPK级联途径的生物学功能26-33
• 1.2.1 在植物生长发育中的作用26-29
• 1.2.1.1 在细胞分裂中的作用27-28
• 1.2.1.2 在细胞分化及发育中的作用28
• 1.2.1.3 在植物生殖发育中的作用28-29
• 1.2.1.4 在植物衰老和器官脱落中的作用29
• 1.2.2 在植物响应生物胁迫中的作用29-31
• 1.2.3 在植物响应非生物胁迫中的作用31-33
• 1.3 植物MAPK的下游作用因子33-35
• 1.4 番茄MAPK级联途径的研究进展35-36
• 2 植物MAPK级联途径基因家族的进化及相关基因的表达分析36-83
• 2.1 材料与方法37-40
• 2.1.1 试验材料37
• 2.1.2 试验试剂37
• 2.1.3 植物MAPK、MAPKK、MAPKKK家族成员鉴定37-38
• 2.1.4 植物MAPK级联途径家族基因序列特征分析38
• 2.1.5 苗期逆境胁迫处理38-39
• 2.1.6 植物MAPK级联途径家族基因的表达分析39-40
• 2.1.6.1 植物总RNA的提取反转录合成cDNA39
• 2.1.6.2 荧光实时定量PCR39-40
• 2.2 结果与分析40-81
• 2.2.1 植物MAPKKK基因家族成员的鉴定及进化分析40-62
• 2.2.1.1 番茄MAPKKK基因的鉴定及表达特征分析40-49
• 2.2.1.2 黄瓜MAPKKK基因家族成员的鉴定及表达分析49-56
• 2.2.1.3 植物MAPKKK基因家族的进化分析56-62
• 2.2.2 植物MAPKK基因家族成员的鉴定及进化分析62-72
• 2.2.2.1 番茄MAPKK基因家族成员的鉴定及表达分析62-66
• 2.2.2.2 黄瓜MAPKK基因家族成员的鉴定及表达分析66-69
• 2.2.2.3 植物MAPKK基因家族的进化分析69-72
• 2.2.3 植物MAPK基因家族成员的鉴定及进化分析72-81
• 2.2.3.1 番茄MAPK基因家族成员的鉴定及表达分析72-74
• 2.2.3.2 黄瓜MAPK基因家族成员的鉴定及表达分析74-78
• 2.2.3.3 植物MAPK基因家族的进化分析78-81
• 2.3 讨论81-83
• 2.3.1 植物MAPKKK基因家族的进化81
• 2.3.2 植物MAPKK基因家族的进化81-82
• 2.3.3 植物MAPK基因家族的进化82-83
• 3 番茄SlMPK13的表达特征及所编码蛋白质的基本特性分析83-99
• 3.1 材料与方法84-91
• 3.1.1 试验材料84
• 3.1.2 试验试剂84
• 3.1.3 SlMPK13的时空表达特性分析84-88
• 3.1.3.1 QRT-PCR分析84-85
• 3.1.3.2 植物组织原位杂交分析85-88
• 3.1.4 SlMPK13的基本特性分析88-91
• 3.1.4.1 原核表达分析88-90
• 3.1.4.2 蛋白SDS-PAGE电泳及Western Blot印迹90
• 3.1.4.3 SlMPK13的亚细胞定位90-91
• 3.2 结果与分析91-97
• 3.2.1 SlMPK13在番茄开放花的雄蕊中优势表达91-94
• 3.2.2 SlMPK13的磷酸化性质分析94-95
• 3.2.3 SlMPK13的亚细胞定位95-97
• 3.3 讨论97-99
• 3.3.1 SlMPK13是一个在成熟花药中优势表达的重要基因97
• 3.3.2 SlMPK13定位于细胞各部位并具有MPK激酶活性97-99
• 4 番茄SlMPK13在花粉发育中的功能鉴定99-127
• 4.1 材料方法100-107
• 4.1.1 试验材料与试验试剂100
• 4.1.2 RNAi载体的构建100-101
• 4.1.2.1 正义片段和反义片段序列扩增100
• 4.1.2.2 CaMV35S组成型启动子的RNAi载体构建100-101
• 4.1.2.3 番茄花粉特异启动子LAT52的RNAi载体构建101
• 4.1.3 RNAi载体对番茄植株的遗传转化101-103
• 4.1.3.1 农杆菌菌株的获得与侵染菌液制备101-102
• 4.1.3.2 番茄无菌苗的培养102
• 4.1.3.3 番茄植株的遗传转化102-103
• 4.1.4 转基因植株的分子检测103-104
• 4.1.4.1 PCR检测103-104
• 4.1.4.2 GUS组织化学染色104
• 4.1.4.3 QRT-PCR检测104
• 4.1.5 转基因番茄植株的表型观察104-107
• 4.1.5.1 转基因番茄植株的形态观察104-105
• 4.1.5.2 花粉生活力观察105-106
• 4.1.5.3 花粉形态扫描电镜观察106
• 4.1.5.4 花粉半薄切片观察106
• 4.1.5.5 花粉形态超薄透射电镜观察106-107
• 4.2 结果与分析107-124
• 4.2.1 抑制SlMPK13表达对番茄营养生长的影响107-111
• 4.2.2 抑制SlMPK13表达对番茄花器官的影响111-113
• 4.2.3 SlMPK13组织特异性抑制表达对番茄花粉发育及坐果的影响113-119
• 4.2.4 抑制SlMPK13表达对花粉超微结构的影响119-124
• 4.3 讨论124-127
• 4.3.1 SlMPK13在番茄生长发育过程中的作用存在多效型124-125
• 4.3.2 SlMPK13在番茄花粉发育过程中起重要作用125-126
• 4.3.3 SlMPK13通过影响细胞膜和液泡的变化而影响番茄花粉发育126-127
• 5 抑制SlMPK13的表达对番茄转录组水平的影响127-139
• 5.1 材料与方法128-130
• 5.1.1 试验材料与试验试剂128
• 5.1.2 植物总RNA提取及质量检测128
• 5.1.3 转录组文库的构建及测序128-129
• 5.1.4 测序数据处理129-130
• 5.2 结果与分析130-137
• 5.2.1 差异基因的鉴定130-132
• 5.2.2 差异表达基因的基因本体论分析132-134
• 5.2.3 差异表达基因的生物学代谢途径分析134-137
• 5.3 讨论137-139
• 5.3.1 转录组测序研究MAPK下游作用因子的可行性137
• 5.3.2 SlMPK13在番茄花粉成熟过程中的调控机制推测137-139
• 结论139-141
• 参考文献141-157
• 附表157-186
• 博士在读期间发表的论文186

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 安新民,张上隆,徐昌杰;柑桔转化酶基因家族新成员的克隆和序列分析[J];上海交通大学学报(农业科学版);2003年01期

2 牛艳梅;沈文涛;周鹏;;Expansin超级家族的进化与命名[J];广东农业科学;2007年08期

3 魏云虎;张煜s，

本文编号：377716