T-2毒素诱导的细胞线粒体毒性作用研究

发布时间：2023-04-26 21:54

　　T-2毒素是由镰刀菌(Fusarium)产生的一种次级代谢产物,也是A类单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种。T-2毒素在自然界中分布非常广泛,在田间生长的作物如大麦、小麦、燕麦、黑麦和玉米,以及储存的谷物都是T-2毒素的污染对象。动物在摄入污染了T-2毒素的饲料后能引起多种毒性作用,肠道和肝脏对T-2毒素尤其敏感。T-2毒素能够降低动物的食欲和增重,引起严重的经济损失。T-2毒素还可能通过食物链进入人们的餐桌,因此对动物和食品动物消费者的健康都具有较大的威胁。T-2毒素对食品动物的一个重要毒性作用是生长抑制效应。动物在长期低剂量摄入T-2毒素污染的饲料后会引起慢性毒性作用,包括食欲不振、生长发育迟缓、体重降低等,并导致动物饲料利用率明显降低,给养殖业带来巨大的经济损失。虽然目前对T-2毒素引起的动物生长抑制有一定的研究,但总的来说,T-2毒素对动物生长抑制的作用机制还不清楚。研究表明T-2毒素可能通过改变大脑中五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平,降低动物的食欲;或者通过抑制动物肠上皮细胞的增殖,损害肠道微绒毛,导致肠道营养吸收受阻。本实验室前期对T-2毒素的...

【文章页数】：257 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 立题依据
    1.2 研究进展
        1.2.1 单端孢霉烯族毒素概述
        1.2.2 T-2毒素概述
        1.2.3 T-2毒素分子作用靶点研究进展
        1.2.4 T-2毒素诱导线粒体损伤和氧化应激研究进展
        1.2.5 转录因子NRF-2的研究进展
    1.3 研究内容和目标
        1.3.1 研究内容
        1.3.2 研究目标
2 T-2毒素诱导GH3细胞线粒体氧化应激和功能变化研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 溶液配制
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 细胞培养
        2.1.6 CCK-8法检测T-2毒素对GH3细胞活力影响
        2.1.7 细胞内氧自由基检测
        2.1.8 ELISA法检测细胞内8-OHdG含量
        2.1.9 细胞GSH含量检测
        2.1.10 抗氧化酶SOD活性检测
        2.1.11 细胞线粒体膜电位ΔΨm检测
        2.1.12 细胞mt-DNA拷贝数检测
        2.1.13 细胞线粒体ATP水平检测
        2.1.14 细胞呼吸链复合物I酶活性检测
        2.1.15 透射电镜观察GH3细胞形态
        2.1.16 细胞凋亡检测
        2.1.17 qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达
        2.1.18 统计学分析
    2.2 结果
        2.2.1 GH3细胞的培养
        2.2.2 细胞总RNA质量鉴定
        2.2.3 T-2毒素对GH3细胞毒性
        2.2.4 T-2毒素诱导GH3细胞线粒体氧化应激
        2.2.5 T-2毒素诱导GH3细胞线粒体功能变化
        2.2.6 T-2毒素激活线粒体依赖的细胞凋亡
    2.3 讨论
        2.3.1 T-2毒素诱导GH3细胞氧化应激并激活抗氧化系统
        2.3.2 线粒体是T-2毒素另一个重要的分子作用靶点
        2.3.3 T-2毒素激活GH3细胞线粒体生物合成
    2.4 小结
3 线粒体呼吸链核心铁硫蛋白亚基Ndufs3的功能研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 细胞株
        3.1.2 质粒
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 溶液配制
        3.1.5 主要仪器
        3.1.6 细胞复苏、传代和冻存
        3.1.7 利用siRNA干扰Ndufs3基因表达
        3.1.8 Ndufs3过表达实验
        3.1.9 Western blot方法测定蛋白表达水平
        3.1.10 qRT-PCR检测RNA干扰水平
        3.1.11 检测线粒体超氧自由基、ΔΨm和ATP水平
        3.1.12 统计学分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 siRNA转染效果和RNA干扰Ndufs3效果评价
        3.2.2 敲低Ndufs3增加线粒体超氧自由基产生
        3.2.3 敲低Ndufs3抑制线粒体呼吸链复合物I活性
        3.2.4 敲低Ndufs3降低细胞线粒体ΔΨm
        3.2.5 敲低Ndufs3不改变线粒体ATP水平
        3.2.6 通过pcDNA-3.1⁺载体在GH3细胞中过表达Ndufs
        3.2.7 pcDNA3.1⁺-Ndufs3重组载体构建
        3.2.8 Ndufs3过表达验证
        3.2.9 过表达Ndufs3不改变线粒体超氧自由基
        3.2.10 过表达Ndufs3不影响线粒体ΔΨm
        3.2.11 过表达Ndufs3不改变线粒体ATP产生
    3.3 讨论
        3.3.1 Ndufs3能够维持GH3细胞线粒体功能稳定
        3.3.2 Ndufs3过表达不能保护线粒体功能
    3.4 小结
4 核呼吸因子2在T-2毒素诱导线粒体功能变化中的作用研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 细胞株
        4.1.2 质粒
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 溶液配制
        4.1.5 主要仪器
        4.1.6 细胞复苏、传代和冻存
        4.1.7 间接免疫荧光试验
        4.1.8 抑制剂筛选调控NRF-2的信号通路
        4.1.9 慢病毒构建NRF-2沉默细胞株
        4.1.10 染色质免疫共沉淀
        4.1.11 Western blot和qRT-PCR确定NRF-2干扰效率
        4.1.12 ROS、ATP、复合物I活性和mt-DNA拷贝数检测
    4.2 结果与分析
        4.2.1 NRF-2在GH3细胞中定位在细胞核
        4.2.2 T-2处理GH3细胞后增加NRF-2表达
        4.2.3 调控NRF-2表达的上游信号通路
        4.2.4 敲低NRF-2改变GH3细胞线粒体功能
        4.2.5 ChIP结合PCR和高通量测序确定NRF-2靶基因
        4.2.6 敲低NRF-2抑制靶基因的表达
    4.3 讨论
        4.3.1 T-2毒素诱导NRF-2核内表达
        4.3.2 NRF-2参与了T-2毒素诱导的线粒体功能变化
        4.3.3 NRF-2控制线粒体靶基因的表达进而影响线粒体功能
        4.3.4 NRF-2通过其他形式来影响线粒体
        4.3.5 NRF-2可能参与的其他功能
    4.4 小结
5 T-2毒素诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬
    5.1 材料与方法
        5.1.1 细胞株
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 溶液配制
        5.1.4 主要仪器
        5.1.5 细胞复苏、传代和冻存
        5.1.6 通过腺相关病毒在GH3中稳定表达mRFP-GFP-LC
        5.1.7 GH3细胞中细胞自噬的观察
        5.1.8 RNA干扰线粒体自噬基因Atg5、Pink1和NIX
        5.1.9 GH3细胞中稳定表达Mito7-mKeima蛋白
        5.1.10 通过Mito7-mKeima确定线粒体自噬
        5.1.11 透射电镜观察线粒体自噬
        5.1.12 qRT-PCR检测线粒体融合与分裂基因表达
        5.1.13 线粒体ATP和细胞凋亡分析
        5.1.14 siRNA转染GH3细胞沉默Nrf2基因
        5.1.15 统计学分析
    5.2 结果与分析
        5.2.1 AAV病毒包装和感染GH3细胞
        5.2.2 T-2毒素能够诱导GH3细胞自噬
        5.2.3 Atg5介导T-2毒素诱导的GH3细胞自噬
        5.2.4 表达Mito7-mKeima的慢病毒包装和感染GH3细胞
        5.2.5 T-2毒素能够诱导GH3细胞线粒体自噬
        5.2.6 Atg5介导T-2毒素诱导GH3细胞线粒体自噬
        5.2.7 透射电镜观察T-2毒素诱导GH3细胞线粒体自噬
        5.2.8 T-2毒素诱导线粒体自噬关键基因表达
        5.2.9 cAMP-PKA-CREB-Nrf2-Pink1调控GH3细胞线粒体自噬
        5.2.10 抑制线粒体自噬降低GH3细胞线粒体功能
        5.2.11 抑制线粒体自噬促进T-2毒素诱导的细胞凋亡
    5.3 讨论
        5.3.1 T-2毒素诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬
        5.3.2 cAMP-PKA-CREB-Nrf2-Pink1是调控线粒体自噬的通路
        5.3.3 线粒体自噬保护GH3细胞线粒体功能并降低细胞死亡
    5.4 小结
6 全文创新性总结
7 单端孢霉烯族毒素引起的线粒体毒性研究进展(综述)
参考文献
致谢
附录



本文编号：3802257