塔里木马鹿（Cervus elaphus yarkandensis）精子体外获能及其相关蛋白酪氨酸磷酸化研究

发布时间：2017-05-21 11:13

  本文关键词：塔里木马鹿（Cervus elaphus yarkandensis）精子体外获能及其相关蛋白酪氨酸磷酸化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis)是我国特有,唯一能栖息于荒漠景观中的马鹿亚种,其在荒漠生物群落中具有重要的生态地位。近年来,由于开发和经济活动等的影响,导致其栖息地萎缩,种群数量日益下降,物种生存面临严重威胁。因此开展其繁殖生物学研究将对其种群延续、恢复具有积极的作用。精子获能是受精的关键,又是复杂的生理现象。精子在获能过程中会发生一系列的生理生化变化并受许多因素的调控,主要的调控因素包括胆固醇受体白蛋白、碳酸氢盐、钙离子和蛋白酪氨酸磷酸化等,其中精子蛋白酪氨酸磷酸化是精子获能、超激活运动力的维持以及发生顶体反应等多种生理生化过程的重要调控因素。目前,精子获能及其主要调控因素的作用机制尚未完全清楚,鹿类精子高效体外获能体系尚未实现。尽管白蛋白、碳酸氢盐和钙离子等可以作为体外获能液的基础成分,来研究精子获能的最初事件,但这三种成分对精子获能能力的影响具有物种特异性,而且即使是同一个物种的研究报道也存在差异。目前所报道的鹿类体外受精(IVF)体系中精子穿透率均较低。本研究借助分子生物学、生物化学和生殖生理学等学科的技术手段,以新疆塔里木马鹿精子为试验材料,从筛选精子体外获能培养体系入手,研究精子体外获能及其获能过程中的关键分子事件—蛋白酪氨酸磷酸化的发生及机制,并在此基础上探讨分析几种主要影响或诱导因子对塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的作用机理。研究结果表明：1、鲜精获能培养前仅检测到3条较清晰的酪氨酸磷酸化蛋白条带,其分子量分别为10 ku、40 ku和47 ku,而获能培养后发生酪氨酸磷酸化蛋白条带增加至7条,其分子量分别为10 ku、14 ku、25 ku、32 ku、40 ku、47 ku和55ku(P0.05)。2、冻精获能培养前仅检测到6条较清晰的酪氨酸磷酸化蛋白,分子量分别为10ku、14 ku、25 ku、40 ku、47 ku和55 ku,而获能培养后多条蛋白发生酪氨酸磷酸化,其分子量分别为10 ku、14 ku、25-32 ku、40 ku、47 ku、55 ku和60-85 ku,而且这些蛋白特别是低分子量蛋白的磷酸化水平随着获能的进行相对提高,并在获能培养1-2 h期间相对较高(P0.05)。3、不同公鹿冻融精子膜蛋白Western blot检测到的酪氨酸磷酸化蛋白差异较大,发生酪氨酸磷酸化蛋白质的分子量较集中在低分子量蛋白上(分子量为10-85 ku之间),高分子量蛋白(分子量85ku以上)几乎不发生酪氨酸磷酸化,不同个体精子蛋白磷酸化水平之间存在一定的差异(P0.05)。4、哺乳动物精子体外获能常规方法能促使塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化,其中IA组、肝素组和咖啡因组的精子获能率及蛋白酪氨酸磷酸化水平均高于对照组和Percool组(P0.05),并分子量分别为35 ku、40 ku、55 ku蛋白的磷酸化水平相对提高(P0.05),尤其是肝素组精子获能率及蛋白酪氨酸磷酸化水平显著高于其它组(P0.05)。5、塔里木马鹿精子体外获能需要BSA、HCO3-及Ca2+的参与。精子体外获能体系中同时或单独缺少BSA、HCO3-和Ca2+时,精子蛋白酪氨酸磷酸化水平降低,而且这种变化随培养时间的延长特别显现出来,相反这三种成分同时存在的情况下精子蛋白酪氨酸磷酸化水平相对较高,特别是低分子量蛋白10 ku、18 ku、25-32 ku的变化较为明显,缺Ca2+和BSA而存在HC03-时的精子蛋白酪氨酸磷酸化水平与缺HC03-和BSA而存在Ca2+时的基本相似,但同时缺少HC03-和Ca2+时精子蛋白酪氨酸磷酸化水平显著降低(P0.05)。提示HC03-和Ca2+在塔里木马鹿精子获能及其蛋白酪氨酸磷酸化过程中具有重要调控作用,而BSA协助增强精子获能及其蛋白酪氨酸磷酸化过程。6、BSA有利于塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化,获能液中添加一定浓度(6-10 mg/mL) BSA能促使塔里木马鹿精子体外获能率及其蛋白酪氨酸磷酸化水平并与低浓度3 mg/mL组相比差异显著(P0.05),特别是分子量为55 ku酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平明显提高(P0.05),但6 mg/mL组与10 mg/mL之间无显著性差异(P0.05),表明BSA最佳使用量为6 mg/mL。7、一定浓度的HC03-有利于塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化,缺少HC03-或浓度较低时,精子活力、精子获能率下降(P0.05)；HC03-浓度15-25mM时精子获能率最高,但HC03-浓度提高至37 mM时反而顶体反应率升高,且均表现出时间依赖性升高(P0.05)。另外,低浓度HC03-条件下酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平较低,而浓度提高到15 mM后分子量40-56 ku蛋白的磷酸化水平相对提高,且呈时间依赖性上调(P0.05)。表明HCO3-最佳使用浓度为25 mM。8、一定浓度的Ca2+有利于塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化,低浓度(0-2.2 mM) Ca2+的各组精子活力基本相同,但高浓度(3.5-5.0 mM) Ca2+明显抑制了精子活力(P0.05),促进了精子提早发生顶体反应(P0.05)；另外,Ca2+浓度越高,发生酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平越低,1.1 mM组相对优于其它组(P0.05),表明Ca2+最佳使用浓度为1.1 mM。9、在塔里木马鹿精子体外获能体系中添加血清有利于获得更好的获能效果,分别添加发情羊血清(ESS),非发情羊血清(NSS)和发情鹿血清(EDS)的结果中ESS诱发的获能精子比例最高,分子量55 ku蛋白的酪氨酸磷酸化水平显著提高(P0.05),表明发情羊血清比发情鹿血清更有效(P0.05)。10、获能体系中发情羊血清存在时无需添加BSA,发情羊血清与肝素结合使用的效果明显优于BSA与肝素结合使用。发情羊血清与肝素结合使用不仅明显提高了部分低分子量蛋白(10±2ku,14±2ku,25±3 ku和47±3 ku)的磷酸化水平,而且还提高了部分高分子量蛋白(70-110 ku)的酪氨酸磷酸化水平(P0.05)。11、所筛选的塔里木马鹿精子体外获能培养适宜体系为：使用修正后的TALP基础液,添加6 mg/mL BSA,洗精、采用上游法收集高活力精子后,以ESS(20%)与肝素(20μg/mL)诱导获能4 h,培养条件为5%C02,38.5℃,饱和湿度。经比较,应用该体系可显著提高分子量分别为10 ku、14 ku、25～32 ku、40 ku、47～55 ku、70～110ku等10余种蛋白的磷酸化水平(P0.05)。
【关键词】：塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis) 精子 体外获能 蛋白酪氨酸磷酸化
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S825
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-18
• 1 绪论18-26
• 1.1 选题背景18-19
• 1.2 文献综述19-25
• 1.2.1 精子在受精前的活化过程19
• 1.2.2 精子获能的调控机制及获能相关的主要因素19-21
• 1.2.3 精子蛋白质酪氨酸磷酸化21-22
• 1.2.4 精子蛋白发生酪氨酸磷酸化的信号转导途径22-23
• 1.2.5 影响精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的主要因素23-24
• 1.2.6 鹿类精子体外获能及其相关蛋白酪氨酸磷酸化研究概况24-25
• 1.3 研究目的、内容及意义25-26
• 2 材料与方法26-37
• 2.1 试验动物,精液采集与冷冻保存26
• 2.2 动物血清的制备26-27
• 2.3 主要仪器设备27
• 2.4 主要试剂,抗体及药品27-28
• 2.5 培养液及处理液28-29
• 2.6 精子体外获能及其检测29-31
• 2.6.1 精子处理方法29
• 2.6.2 诱导精子体外获能的方法29-30
• 2.6.3 精子质量检测和获能水平的评价30-31
• 2.7 精子膜蛋白酪氨酸磷酸化检测(Western blotting)31-34
• 2.7.1 精子膜蛋白的提取31-32
• 2.7.2 精子膜蛋白的SDS-PAGE电泳32-33
• 2.7.3 精子酪氨酸磷酸化蛋白的检测33-34
• 2.8 数据处理与统计分析34-35
• 2.9 研究内容及试验设计35-37
• 2.9.1 对比塔里木马鹿鲜精与冻精体外获能及酪氨酸磷酸化蛋白的差异表达35
• 2.9.2 对比不同个体冻融精子酪氨酸磷酸化蛋白的差异表达35
• 2.9.3 筛选最适宜塔里木马鹿精子处理方法35
• 2.9.4 筛选最适宜塔里木马鹿精子体外获能培养液35
• 2.9.5 筛选最适宜塔里木马鹿精子体外获能方法35
• 2.9.6 塔里木马鹿精子体外获能与培养基中基础成分Ca~(2+)、HCO_3~-及BSA的必要性及其协同作用的探讨35-36
• 2.9.7 筛选精子获能培养基中基础成分Ca~(2+)、HCO_3~-及BSA的适宜浓度36
• 2.9.8 对比不同血清对塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响36
• 2.9.9 对比探讨血清和BSA与肝素结合使用对塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响36
• 2.9.10 塔里木马鹿精子体外获能最佳培养体系的筛选及其验证36-37
• 3 试验结果37-80
• 3.1 塔里木马鹿精子的CTC染色分类37
• 3.2 塔里木马鹿鲜精和冻精体外获能及蛋白酪氨酸磷酸化的比较37-41
• 3.2.1 鲜精和冻精活力及存活时间的比较37-38
• 3.2.2 鲜精和冻精体外获能率的比较38-39
• 3.2.3 鲜精和冻精顶体反应率的比较39
• 3.2.4 鲜精和冻精酪氨酸磷酸化蛋白的差异表达39-41
• 3.3 塔里木马鹿不同个体冻融精子酪氨酸磷酸化蛋白的差异表达41-42
• 3.4 冻精不同处理方法对塔里木马鹿活动精子回收率及体外获能效果的影响42-46
• 3.4.1 冻精不同处理方法对活动精子回收率的影响42-43
• 3.4.2 冻精不同处理方法对精子活力及其存活时间的影响43-44
• 3.4.3 冻精不同处理方法对精子体外获能效果的影响44-46
• 3.5 不同培养液对冻融塔里木马鹿精子体外获能效果的影响46-48
• 3.5.1 不同培养液对精子活力及存活时间的影响46-47
• 3.5.2 不同培养液对精子体外获能效果的影响47-48
• 3.6 不同获能方法对冻融塔里木马鹿精子体外获能及蛋白酪氨酸磷酸化的影响48-50
• 3.6.1 不同获能方法对精子体外获能效果的影响48-49
• 3.6.2 不同获能方法对冻融塔里木马鹿精子蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响49-50
• 3.7 BSA、HCO_3~-和Ca~(2+)对冻融塔里木马鹿精子体外获能及蛋白酪氨酸磷酸化的影响50-66
• 3.7.1 BSA、HCO_3~-和Ca~(2+)协同对冻融塔里木马鹿精子体外获能及蛋白酪氨酸磷酸化的影响50-54
• 3.7.2 BSA对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响54-58
• 3.7.3 HCO_3~-对冻融塔里木马鹿精子体外获能及蛋白酪氨酸磷酸化的影响58-62
• 3.7.4 Ca~(2+)对冻融塔里木马鹿精子体外获能及蛋白酪氨酸磷酸化的影响62-66
• 3.8 血清与肝素结合使用对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响66-74
• 3.8.1 不同血清对冻融塔里木马鹿精子体外获能及蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响66-70
• 3.8.2 发情羊血清(ESS)和BSA与肝素(Hep)交叉使用对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响70-74
• 3.9 塔里木马鹿精子体外获能最佳培养体系的验证74-80
• 3.9.1 3种精子体外获能体系的比较74-77
• 3.9.2 塔里木马鹿精子体外获能体系的验证77-80
• 4 分析与讨论80-89
• 4.1 塔里木马鹿鲜精与冻精获能过程中精子活力、获能率、顶体反应率的变化80
• 4.2 塔里木马鹿鲜精与冻精获能过程中酪氨酸磷酸化蛋白的变化80-81
• 4.3 塔里木马鹿不同个体冻融精子蛋白酪氨酸磷酸化表达水平的比较81-82
• 4.4 冻精不同处理方法对塔里木马鹿活动精子回收率及体外获能效果的影响82
• 4.5 不同培养液对塔里木马鹿冻融精子体外获能效果的影响82-83
• 4.6 不同获能方法对塔里木马鹿精子体外获能效果及蛋白酪氨酸磷酸化的影响83-84
• 4.7 BSA、HCO_3~-和Ca~(2+)协同对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响84-85
• 4.8 BSA对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响85
• 4.9 碳酸根离子(HCO_3~)对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响85-86
• 4.10 钙离子(Ca~(2+))对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响86-87
• 4.11 血清和肝素协同对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响87-89
• 结论89-90
• 参考文献90-101
• 攻读学位期间发表的学术论文101-102
• 致谢102-103

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘伟石;李和平;邹琦;任艳玲;;γ-氨基丁酸诱发马鹿精子顶体反应[J];东北林业大学学报;2009年09期

2 李东全,罗光彬,张小华,袁水桥,朱增娟;哺乳动物精子获能的分子机制[J];动物医学进展;2005年08期

3 李贺娟;倪和民;薛君忠;张宏;杨飞鸽;刘烈琴;;钙离子浓度对绵羊精子获能的影响[J];中国畜牧兽医;2009年10期

4 梁鸿斌;刘靖清;李复煌;许海涛;牛嘉颖;李晶;孙洋;郭勇;刘云海;;利用CTC染色进行猪精子不同体外获能方法的比较[J];中国畜牧兽医;2010年04期

5 林金杏;阎萍;;甲基黄嘌呤类生物碱在精子体外处理中的应用[J];黑龙江动物繁殖;2006年04期

6 高庆华,韩春梅,何良军;天山马鹿胚胎移植技术的研究[J];经济动物学报;2005年02期

7 李英,侯健,郑云胜,顾文艺,郭志勤;肝素和羊血清对绵羊附睾精子体外获能的影响[J];内蒙古农牧学院学报;1998年04期

8 张莉,张习春,肖杭;精子获能中HCO_3~-介导的信号转导途径[J];生理科学进展;2003年02期

9 周晨曦,王晓飞,陈小章;雌性生殖道碳酸氢根分泌机制及其对精子受精能力的影响(英文)[J];生理学报;2005年02期

10 孔丽娟;李忠浩;黄静燕;代婷婷;王根林;;酪氨酸磷酸化蛋白在体外获能豚鼠精子上的分布与表达[J];中国生物工程杂志;2007年04期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 徐境羚;马鹿精子膜蛋白纯化与理化性质分析[D];东北林业大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 任艳玲;孕酮、γ-氨基丁酸诱发马鹿精子顶体反应及对离子转运调节的研究[D];东北林业大学;2006年

2 柯冬蕾;马鹿精子膜蛋白提取方法筛选及电泳体系优化的研究[D];东北林业大学;2008年

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