二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物作用靶标的鉴定和验证

发布时间：2017-05-22 14:04

  本文关键词：二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物作用靶标的鉴定和验证，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：新农药创制的基础是靶标的创新,研究药物作用靶标可以为新农药的创制提供思路,而以天然产物为探针是发现新靶标的主要途径。从植物苦皮藤根皮部分离鉴定出的一系列二氢沉香呋喃多元酯类化合物具有杀虫活性,但其作用机理尚不明确。本文以东方粘虫幼虫(Mythimna separata Walker)为供试昆虫,对二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物的作用靶标进行了鉴定和验证,为创制一类作用于昆虫消化系统的新型杀虫剂提供新的思路。主要研究方法与结果如下:1.采用靶标鉴定的亲和层析方法,以苦皮藤素V为二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物的代表,在其C-6位衍生合成氨基乙酸酯,通过自发偶联与CNBr活化的Sepharose 4B反应生成亲和基质,从粘虫幼虫中肠BBMV提取物中分离结合蛋白。经质谱鉴定,获得11个如下结合蛋白:锌指蛋白(Zinc finger protein)、跨膜蛋白1(Transmembrane protein 1)、硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase(TPx))、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、E3 SUMO-蛋白连接酶RanBP2(SUMO E3 ligase RanBP2)、肌动蛋白(actin)、氨肽酶N3(APN3)、V-ATPase a亚基、B亚基和H亚基。结合文献已报道的前期症状学观察结果及这些蛋白的功能推测可知,APN和V-ATPase为疑似靶酶。2.采用口腔直接饲喂法测定了12个供试二氢沉香呋喃多元酯类化合物对5龄粘虫的毒力,供试化合物KV-6-N-甲基靛红酸酯(KV-6-MIA)、KV-6-异丁酸酯、KV-6-酮、NW57、NW62在供试浓度668.45μg/g剂量下对供试5龄粘虫不表现出胃毒活性;雷公藤次碱(WR)、苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、NW69、NW03、NW70对供试5龄粘虫有胃毒活性,LD50分别为:0.597、679.479、33.605、767.811、309.559、379.286、86.271μg/g。测定了12个供试二氢沉香呋喃多元酯类化合物对粘虫幼虫中肠APN和V-ATPase活性的影响,结果表明,该类化合物对APN活性没有影响,但是大多数该类化合物对V-ATPase活性有抑制作用。供试化合物苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、KV-6-异丁酸酯、KV-6-酮、KV-6-N-甲基靛红酸酯(KV-6-MIA)、NW69、NW70、NW03、NW57、NW62、雷公藤次碱(WR)对V-ATPase活性的抑制率分别为:14.19%、19.83%、12.72%、12.30%、6.72%、24.04%、12.63%、29.64%、33.98%、1.9%、6.90%、54.78%。供试化合物的杀虫活性与对试虫中肠V-ATPase的抑制活性呈正相关性,说明二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物的作用靶酶为V-ATPase。3.基于V-ATPase H亚基功能的重要性,采用RACE技术对粘虫幼虫中肠V-ATPase H亚基进行克隆。获得了粘虫幼虫中肠H亚基基因1807 bp,其中CDS区基因的全长共1425 bp,5'-UTR为136 bp,3'-UTR为246 bp。CDS区编码474个氨基酸,经预测编码氨基酸的分子量为54.8 KDa,等电点(pI)为6.26。4.采用微量热泳动(MST)技术,测定供试12个二氢沉香呋喃多元酯类化合物与H亚基的相互作用,结果表明KV-6-酮、KV-6-N-甲基靛红酸酯(KV-6-MIA)、KV-6-异丁酸酯、NW57、NW62不与H亚基结合,苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、NW70、NW69、NW03、雷公藤次碱(WR)与H亚基结合,通过拟合结合曲线计算得解离常数KD值分别为:253.0、144.0、156.0、164.0、186.0、203.0、59.0μM。经过KD值与杀虫毒力LD50及对V-ATPase活性抑制率的相关性分析知,二氢沉香呋喃多元酯类化合物的作用靶标是V-ATPase H亚基。5.借助Discovery Studio软件,采用同源建模法,以已知结构的酵母H亚基为模型,构建了东方粘虫幼虫中肠V-ATPase H亚基的模型,并预测了18个可能的结合位点。利用分子对接技术,将供试12个二氢沉香呋喃多元酯类化合物与H亚基模型对接,通过对接得分与KD值相关性分析可知,位于H亚基C端结构域空腔内的位点17(其氨基酸残基为半光氨酸(Cys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、丝氨酸(Ser)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)等)为可能的作用位点。
【关键词】：二氢沉香呋喃多元酯 V-ATP酶 V-ATP酶H亚基 靶标鉴定 靶标验证 分子对接 东方粘虫
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S482.3
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 文献综述15-41
• 1.1 新药创制与靶标创新15-18
• 1.1.1 粮食安全和环境安全需要不断创制新农药15
• 1.1.2 我国农药创新现状15-16
• 1.1.3 新农药创制的最新趋势是基于化学蛋白组学分子靶标导向的绿色农药创制16-18
• 1.2 V-ATPASE作为药物靶标的研究现状18-34
• 1.2.1 V-ATPase的结构与功能19-23
• 1.2.2 昆虫V-ATPase23-27
• 1.2.3 V-ATPase抑制剂27-34
• 1.3 苦皮藤素V作用机理研究进展34-38
• 1.3.1 苦皮藤素V的症状学研究35-36
• 1.3.2 苦皮藤素V对昆虫部分酶系活性的影响36
• 1.3.3 苦皮藤素V的电生理研究36-37
• 1.3.4 苦皮藤素V选择性作用机理研究37-38
• 1.4 论文设计思想38-41
• 1.4.1 选题背景、目的及科学意义38-39
• 1.4.2 研究内容39-40
• 1.4.3 研究技术路线40-41
• 第二章 结合蛋白的分离及鉴定41-50
• 2.1 实验材料41-42
• 2.1.1 试虫41
• 2.1.2 供试化合物与试剂41
• 2.1.3 主要仪器41-42
• 2.2 实验方法42-45
• 2.2.1 连接配体的合成42-43
• 2.2.2 基于粘虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡（BBMV）的亲和层析43-44
• 2.2.3 电泳检测及结合蛋白的鉴定44-45
• 2.3 结果与分析45-47
• 2.3.1 连接配体的合成45
• 2.3.2 结合蛋白的洗脱45-46
• 2.3.3 电泳检测与质谱鉴定46-47
• 2.4 小结与讨论47-50
• 第三章 二氢沉香呋喃多元酯类化合物对昆虫V-ATPASE和氨肽酶活性的影响50-61
• 3.1 实验材料50-52
• 3.1.1 试虫50
• 3.1.2 供试化合物50-51
• 3.1.3 主要试剂51-52
• 3.1.4 主要仪器52
• 3.1.5 主要缓冲液52
• 3.2 实验方法52-55
• 3.2.1 二氢沉香呋喃多元酯类化合物的杀虫活性52-53
• 3.2.2 苦皮藤素V对氨肽酶N（APN）活性的影响53-54
• 3.2.3 二氢沉香呋喃多元酯类化合物对粘虫中肠V-ATPase活性的影响54-55
• 3.3 结果与分析55-59
• 3.3.1 二氢沉香呋喃多元酯类化合物的杀虫活性55-56
• 3.3.2 苦皮藤素V对氨肽酶（APN）活性的影响56-57
• 3.3.3 二氢沉香呋喃多元酯类化合物对粘虫幼虫中肠V-ATPase活性影响57-58
• 3.3.4 二氢沉香呋喃多元酯类化合物杀虫活性与对V-ATPase活性抑制率的相关性分析58-59
• 3.4 小结与讨论59-61
• 第四章 粘虫V-ATPASE H亚基全长CDNA克隆和表达分析61-79
• 4.1 实验材料61-62
• 4.1.1 试虫61
• 4.1.2 主要试剂61
• 4.1.3 主要仪器61-62
• 4.2 实验方法62-69
• 4.2.1 粘虫V-ATPase H亚基全长cDNA的克隆62-68
• 4.2.2 粘虫V-ATPase H亚基全长cDNA序列的生物信息学分析及系统发育树的构建68
• 4.2.3 粘虫中肠V-ATPase H亚基表达的生长发育表达特征68-69
• 4.3 结果与分析69-77
• 4.3.1 粘虫V-ATPase H亚基cDNA部分基因克隆69-71
• 4.3.2 粘虫中肠V-ATPase H亚基cDNA的 3′RACE71-73
• 4.3.3 粘虫中肠V-ATPase H亚基cDNA的 5'RACE73
• 4.3.4 粘虫V-ATPase H亚基cDNA 3′和 5′RACE的序列验证73-75
• 4.3.5 序列分析75-76
• 4.3.6 粘虫中肠V-ATPase H亚基表达的生长发育表达特征76-77
• 4.4 小结与讨论77-79
• 第五章 二氢沉香呋喃多元酯类化合物和粘虫V-ATPASE H亚基的结合亲和性分析79-96
• 5.1 实验材料79-80
• 5.1.1 试虫79
• 5.1.2 菌株与表达载体79
• 5.1.3 主要试剂79-80
• 5.1.4 主要仪器80
• 5.2 实验方法80-84
• 5.2.1 粘虫V-ATPase H亚基的原核表达80-82
• 5.2.2 粘虫V-ATPase H亚基的纯化82
• 5.2.3 二氢沉香呋喃多元酯类化合物和粘虫V-ATPase H亚基蛋白的结合亲和性与其胃毒活性和V-ATP酶抑制率的相关性分析82-84
• 5.3 结果与分析84-95
• 5.3.1 粘虫V-ATPase H亚基的原核表达与纯化84-90
• 5.3.2 二氢沉香呋喃多元酯类化合物和粘虫V-ATPase H亚基蛋白的结合亲和性与其胃毒活性和对V-ATP酶抑制率的相关性90-95
• 5.4 小结与讨论95-96
• 第六章 东方粘虫幼虫中肠V-ATPASE H亚基同源模建及分子对接96-112
• 6.1 实验材料96-98
• 6.2 实验方法98-99
• 6.2.1 粘虫V-ATPase H亚基模型的构建98-99
• 6.2.2 二氢沉香呋喃多元酯类化合物与东方粘虫幼虫中肠V-ATPase H亚基的分子对接及结合位点的预测99
• 6.3 结果与分析99-111
• 6.3.1 目的蛋白序列与模板蛋白序列的比对99-100
• 6.3.2 3D模型的构建100-101
• 6.3.3 模型评估101-103
• 6.3.4 粘虫V-ATPase H亚基和二氢沉香呋喃多元酯类化合物活性位点确定及分子对接103-111
• 6.4 小结与讨论111-112
• 第七章 讨论与结论112-119
• 7.1 讨论112-116
• 7.1.1 二氢沉香呋喃多元酯类杀虫化合物的作用靶标112-114
• 7.1.2 二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物的结合位点114
• 7.1.3 二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物的作用机理114-116
• 7.2 结论116-118
• 7.3 论文主要创新点118
• 7.4 尚需研究的问题118-119
• 参考文献119-131
• 附录131-135
• 附录1 化合物谱图131-133
• 附录2 缓冲液配制133-134
• 附录3 缩略词134-135
• 致谢135-136
• 作者简介136

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