桉树生殖生物学基础与染色体加倍技术研究

发布时间：2017-05-24 20:09

  本文关键词：桉树生殖生物学基础与染色体加倍技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：桉树是世界上人工种植最广泛的速生常绿阔叶树种,具有生长快、材质好、用途广等特点,经济、生态和社会效益巨大。目前,因其生殖生物学基础薄弱以及选择和杂交育种技术的局限性等原因,致使桉树遗传改良研究多年未取得突破性进展。引入综合杂合效应和倍性效应的多倍体育种技术,对实现桉树新品种选育技术突破与种质创新具有重要的理论和实践意义。本研究以尾叶桉(Eucalyptus urophylla) 'U51'、尾细桉(Eucalyptus urophylla × E. tereticornis) 'DH101-1'、尾巨桉(Eucalyptus urophylla ×E.grandis) 'DH18-16'等桉树无性系为材料,在研究掌握桉树生殖生物学基础上,开展非离体理化诱导桉树染色体加倍技术研究,相关研究结果如下：1.突破了桉树生殖生物学研究的技术瓶颈,实现了花发育进程关键时期节点判别和大孢子发生发育进程的切片观察。通过连续多年大量制片的观察统计,证明花蕾外层蒴盖脱落是小孢子母细胞即将进入减数分裂时期的形态学判别标志,解决了孕蕾期平均长达5个月的尾叶桉、尾细桉、尾巨桉等双蒴盖亚属桉树花发育时间节点难以判定的问题；提出将桉树子房内的胚珠连同其着生的胎座整体剥离、沿胎座轴将心皮切分后单独浸蜡、按与刀片平行角度纵向连续切片等技术措施,解决了常规石蜡切片因桉树花蕾革质致使药液无法渗入而导致材料难以充分浸蜡,以及因切片角度偏离导致难以观察到胚珠纵切面等技术难题。有关技术问题的解决,为顺利开展桉树生殖生物学基础研究奠定了技术基础。2.掌握了尾细桉‘DH101-1’等桉树小孢子发生发育规律,提出了利用花蕾形态变化估测小孢子母细胞减数分裂进程的技术方法。研究表明,3种桉树小孢子母细胞减数分裂属于同时型,未观察到多价体、落后染色体等异常行为；不同种桉树花序上不同位置的花蕾发育存在不同步性,其中尾细桉‘DH101-1’靠近花枝基部着生的花蕾发育先于靠近于顶部的花蕾,而尾巨桉‘DH18-16’则表现为靠近花枝顶部着生的花蕾发育更为提前；桉树同一花蕾内小孢子母细胞减数分裂同样存在不同步性,来源于同一花蕾内长、短两种花丝长度雄蕊的小孢子母细胞减数分裂的时序性差异,外圈长花丝雄蕊小孢子发生、发育进程总是先于内圈短花丝雄蕊；花蕾直径与小孢子发生、发育进程存在相关,可以利用花蕾直径大小估测雄蕊小孢子发生、发育时期。当外层蒴盖脱落后,发育最快的花蕾直径在3.0mm左右时,达到小孢子母细胞减数分裂细线期至粗线期；花蕾直径在3.5mm左右时,达到小孢子母细胞减数分裂前期Ⅱ至四分体时期。有关研究为人工诱导桉树花粉染色体加倍奠定了理论和技术基础。3.掌握了尾细桉‘DH101-1’大孢子发生发育时序规律,提出了利用同花蕾内长、短花丝雄蕊小孢子发生、发育时期即时判别大孢子母细胞减数分裂进程的技术方法。通过对尾细桉‘DH101-1’花蕾的大量切片观察统计表明,尾细桉靠近胎座顶部着生的胚珠存在一定比率的发育异常现象,其中正常胚珠内大孢子母细胞减数分裂并无异常,胚囊发育类型为蓼型；花枝上不同位置的花蕾发育存在不同步性,其中靠近花枝基部着生的花蕾大孢子发生发育先于靠近顶部的花蕾；大孢子发生及胚囊发育进程与小孢子发生、发育存在时序性相关规律,当同花蕾长花丝雄蕊处于减数分裂中期Ⅰ至末期Ⅰ时,短花丝雄蕊处于减数分裂间期,此时大孢子母细胞达到减数分裂粗线期；长花丝雄蕊处于减数分裂前期Ⅱ至末期Ⅱ时,短花丝雄蕊处于减数分裂细线期至粗线期,此时大孢子母细胞处于减数分裂双线期至终变期；长花丝雄蕊发育至二核小孢子时,胚囊已至成熟胚囊时期；典型对应发育时期的重合率达84.13%；可以利用较易制片观察的小孢子发生、发育进程即时判别同花蕾大孢子发生及胚囊发育时期。有关研究结果对于实现雌配子染色体加倍即时处理具有重要意义。4.提出了一种利用秋水仙碱溶液滴注式处理诱导花粉染色体加倍的技术方法,首次人工诱导获得桉树2n花粉。在解决桉树生殖生物学基础以及观测和判别技术的基础上,开展了施加高温和秋水仙碱溶液等理化处理诱导桉树配子染色体加倍技术研究,探索了高温处理诱导桉树雌雄配子染色体加倍的技术条件,初步研究结果表明来源于亚热带的桉树可能对高温处理不敏感；施加秋水仙碱溶液处理诱导桉树花粉染色体加倍的效果优于施加高温处理,最佳的处理方式为缓释滴注式渗透处理,在小孢子母细胞减数分裂双线期至后期Ⅰ,采用0.5%秋水仙碱溶液连续处理6h,处理有效率达到28.71%。相对于正四面体型的正常单倍性花粉,获得的2n花粉形态为球形,体积平均增大40%。施加0.5%秋水仙碱溶液处理诱导大孢子及胚囊染色体加倍的结果有待种子收获后育苗检测。桉树花粉染色体加倍的成功,预示着通过诱导雌配子染色体加倍选育桉树三倍体具有成功的可行性,对桉树多倍体育种工作具有重要的指导价值。
【关键词】：桉树 小孢子发生 大孢子发生 胚囊发育 染色体加倍
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S792.39
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 1 引言12-14
• 2 文献综述及研究内容14-30
• 2.1 桉树概述14-16
• 2.2 桉树育种研究进展16-21
• 2.2.1 桉树遗传改良的目标16
• 2.2.2 桉树遗传变异研究概况16-17
• 2.2.3 桉树选择育种及引种研究进展17-18
• 2.2.4 桉树杂交育种研究进展18-21
• 2.2.5 桉树繁殖技术研究进展21
• 2.3 林木多倍体育种研究进展21-28
• 2.3.1 多倍体木本植物的特征21-22
• 2.3.2 自然界天然多倍体的存在及利用22-23
• 2.3.3 林木多倍体的诱导途径23-26
• 2.3.4 人工诱导多倍体的技术方法26-27
• 2.3.5 多倍体植株的鉴定27-28
• 2.4 问题与展望28-29
• 2.5 本研究的内容及意义29-30
• 3 材料与方法30-38
• 3.1 研究材料及来源30
• 3.2 研究方法30-38
• 3.2.1 实验样本测量、固定和数据记录30-31
• 3.2.2 小孢子母细胞减数分裂及小孢子发育进程观察31-32
• 3.2.3 大孢子发生及胚囊发育进程观察32
• 3.2.4 花粉染色体加倍32-34
• 3.2.5 大孢子及胚囊染色体加倍34-35
• 3.2.6 种子收集、播种及苗木管理35
• 3.2.7 子代植株倍性水平检测35-38
• 4 结果与分析38-86
• 4.1 桉树小孢子母细胞减数分裂及其发育进程的研究38-56
• 4.1.1 小孢子母细胞减数分裂进程与小孢子发育38-47
• 4.1.2 桉树花蕾形态与小孢子发生发育进程关系研究47-55
• 4.1.3 小结55-56
• 4.2 桉树大孢子发生及胚囊发育进程的研究56-69
• 4.2.1 尾细桉‘DH101-1’子房结构观察与石蜡切片技术56-58
• 4.2.2 尾细桉‘DH101-1’大孢子母细胞减数分裂进程58-60
• 4.2.3 尾细桉‘DH101-1’胚囊发育进程60-61
• 4.2.4 桉树雌、雄配子发生及胚囊发育进程关系的研究61-66
• 4.2.5 由胚珠早期发育异常导致的雌配子败育66-68
• 4.2.6 小结68-69
• 4.3 桉树花粉染色体加倍技术的研究69-76
• 4.3.1 高温处理诱导尾叶桉‘U51’花粉染色体加倍研究70-71
• 4.3.2 秋水仙碱溶液诱导2n花粉加倍71-73
• 4.3.3 秋水仙碱溶液诱导2n花粉加倍的最佳处理时期73-75
• 4.3.4 小结75-76
• 4.4 桉树大孢子及胚囊染色体加倍技术研究76-86
• 4.4.1 尾细桉‘DH101-1’大孢子及胚囊发育进程的判定77-79
• 4.4.2 高温处理诱导尾细桉‘DH101-1’大孢子染色体加倍79-82
• 4.4.3 高温处理诱导尾细桉‘DH101-1’胚囊染色体加倍82-83
• 4.4.4 施加秋水仙碱溶液处理诱导尾细桉‘DH101-1’大孢子及胚囊染色体加倍83-85
• 4.4.5 小结85-86
• 5 讨论86-94
• 5.1 桉树花发育关键时期节点判别和制片技术86-87
• 5.2 桉树小孢子发生、发育特点87-88
• 5.3 桉树子房解剖特点及大孢子发生与胚囊发育规律88-89
• 5.4 桉树大、小孢子发生及胚囊发育进程的判别89-91
• 5.5 施加理化处理诱导桉树配子染色体加倍91-94
• 6 结论94-98
• 参考文献98-114
• 个人简介114-116
• 导师简介116-118
• 成果清单118-120
• 致谢12

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