长牡蛎DNA甲基化研究

发布时间：2017-05-26 01:03

  本文关键词：长牡蛎DNA甲基化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：表观遗传学是指在DNA序列不发生改变的情况下基因表达发生的可遗传的改变,DNA甲基化是目前研究最为成熟的一种表观遗传修饰,与基因组防御、基因表达调控密切相关。目前DNA甲基化的研究主要集中在哺乳动物及植物中,水产动物的研究相对匮乏。长牡蛎{Crassostrea gigas)又名太平洋牡蛎,是我国乃至世界上产量最大的海产经济贝类,因其生活于环境多变的潮间带并且具有复杂的生物学特征而成为水产动物研究的模式生物,对长牡蛎的DNA甲基化进行研究有助于了解水产动物DNA甲基化的分子机制和功能,解析水产动物复杂生物学特征及对环境适应性的调控机理。本研究针对长牡蛎开展了DNA甲基化的基础研究,分析了DNA甲基化的遗传模式、组织特异性及三倍体和选育群体中DNA甲基化的变异,以期为后期相关研究提供理论基础。1、长牡蛎DNA甲基化的遗传模式采用荧光标记的甲基化敏感扩增多态性(F-MSAP)方法,研究长牡蛎亲本甲基化和非甲基化位点在子代的分离,检测DNA甲基化在亲子代间的遗传模式。结果发现,长牡蛎90.6%的亲本甲基化位点遵循孟德尔定律稳定遗传给子代,甲基化位点较非甲基化位点更加偏离孟德尔分离比,与亲本相比,子代存在22个去甲基化位点,7个超甲基化位点和30个从头甲基化位点。2、DNA甲基化在长牡蛎不同组织中的分化采用F-MSAP方法对10只野生长牡蛎6个组织(鳃、外套膜、闭壳肌、唇瓣、性腺、消化盲囊)的基因组甲基化进行检测。结果发现,长牡蛎不同组织间DNA甲基化水平存在差异,消化盲囊、唇瓣、闭壳肌组织的甲基化水平较高,其中消化盲囊与鳃和外套膜组织的甲基化水平差异显著,其他组织间差异并不显著。长牡蛎中存在组织特异性和非组织特异性甲基化位点,然而由于牡蛎杂合度高,个体之间差异较大,未发现10个个体一致存在的组织特异性／非组织特异性甲基化位点。3、长牡蛎三倍体基因组DNA甲基化研究采用细胞松弛素B诱导产生长牡蛎二倍体和三倍体家系,采用F-MSAP方法对二倍体和三倍体的闭壳肌和性腺组织的DNA甲基化进行分析。结果发现,二倍体与三倍体长牡蛎整体DNA甲基化水平在闭壳肌和性腺组织中都不存在差异,仅存在少量倍性特异性位点。通过与亲本基因型比较发现,三倍体的甲基化位点和未甲基化位点的变异率都高于二倍体。基于主成分分析方法对二倍体和三倍体的闭壳肌及性腺组织的表观遗传结构分析显示,长牡蛎不同倍性及不同组织之间的表观遗传结构存在较大差异,这暗示了二倍体与三倍体可能在某些甲基化位点存在差异,而不引起整体甲基化水平的变化。二倍体和三倍体长牡蛎中,都存在雄性特异性甲基化位点,未发现雌性中特有的甲基化位点。4、长牡蛎三倍体生殖相关基因表达与甲基化模式分析采用定量PCR对8个生殖相关基因在增值期和成熟期的二倍体和三倍体性腺组织的表达水平进行分析,结果发现只有增殖期的putative Vg基因和成熟期的caER基因在二倍体与三倍体中表达差异显著。采用亚硫酸盐处理测序方法对这两个基因的启动子及编码区的CpG岛甲基化情况进行分析,结果发现Putative Vg基因启动子及编码区含有6个CpG岛,但所有CpG岛不存在胞嘧啶甲基化修饰,caER基因启动子区域无CpG岛,编码区含有5个CpG岛,位于第六外显子和第十外显子的CpG岛存在甲基化修饰,其中第六外显子CpG岛胞嘧啶甲基化在二倍体和三倍体中不存在差异,而第十外显子CpG岛胞嘧啶甲基化在二倍体和三倍体中存在差异,可能与基因表达调控相关。5、长牡蛎人工选育群体DNA甲基化研究采用扩增片段长度多态性(AFLP)方法和甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法对长牡蛎快生长品系“海大一号”基础群体和选育群体的遗传及表观遗传变异进行分析。结果显示基础群体与选育群体总体DNA甲基化水平并无差异,然而对每个甲基化位点在两个群体中出现频率进行分析发现,82个甲基化位点中有9个位点在两个群体中出现的频率存在显著差异。协惯量方差分析显示表观遗传结构与遗传结构显著相关,但是部分个体具有相似的遗传结构却表现出差异较大的表观遗传结构,选育群体的遗传多样性与表观遗传多样性都略低于基础群体。综上所述,长牡蛎DNA甲基化的遗传模式基本符合孟德尔遗传定律,在不同组织、不同倍性及选育过程中会发生一定频率的变异,这些变异有可能与基因差异表达有关。
【关键词】：长牡蛎 DNA甲基化 遗传 组织特异性 三倍体 人工选育
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 第一章 文献综述14-37
• 第一节 表观遗传学14-19
• 第二节 DNA甲基化19-30
• 1 DNA甲基化的作用机制19-22
• 1.1 DNA甲基化的概念与特点19-20
• 1.2 DNA甲基化与去甲基化机制20-22
• 1.3 DNA甲基化调控基因表达的机制22
• 2 DNA甲基化的遗传与变异22-25
• 2.1 DNA甲基化的遗传22-23
• 2.2 DNA甲基化的变异23-25
• 3 DNA甲基化的生物学功能25-30
• 3.1 DNA甲基化与基因组防御26
• 3.2 DNA甲基化与发育分化26-27
• 3.3 DNA甲基化与基因印记27-28
• 3.4 DNA甲基化与X染色体失活28
• 3.5 DNA甲基化与疾病28-30
• 第三节 DNA甲基化在水产动物中的研究进展30-35
• 第四节 本研究的目标和主要研究内容35-37
• 1 研究目标35
• 2 研究内容35-37
• 2.1 长牡蛎DNA甲基化的遗传模式35
• 2.2 长牡蛎DNA甲基化的组织特异性35-36
• 2.3 长牡蛎三倍体基因组DNA甲基化36
• 2.4 长牡蛎三倍体生殖相关基因表达与甲基化模式36
• 2.5 长牡蛎人工选育群体DNA甲基化变异36-37
• 第二章 长牡蛎DNA甲基化遗传模式及组织特异性37-56
• 第一节 DNA甲基化在长牡蛎亲子代间的遗传37-48
• 0 引言37-38
• 1 材料与方法38-43
• 1.1 实验材料38
• 1.2 实验方法38-41
• 1.3 数据分析41-43
• 2 结果43-45
• 2.1 长牡蛎亲子代在CCGG位点的胞嘧啶甲基化水平43
• 2.2 长牡蛎亲子代间DNA甲基化模式的遗传与变异43-45
• 3 讨论45-48
• 3.1 长牡蛎DNA甲基化模式分析45-46
• 3.2 长牡蛎DNA甲基化模式的遗传与变异46-48
• 第二节 DNA甲基化在长牡蛎不同组织中的分化48-56
• 0 引言48-49
• 1 材料和方法49-50
• 1.1 实验材料49
• 1.2 实验方法49-50
• 2 结果与分析50-53
• 2.1 不同组织基因组DNA甲基化水平分析50-51
• 2.2 组织特异性分析51-52
• 2.3 长牡蛎遗传背景分析52-53
• 3 讨论53-56
• 3.1 长牡蛎不同组织甲基化水平分析53-54
• 3.2 组织特异性甲基化功能分析54-56
• 第三章 长牡蛎三倍体DNA甲基化研究56-89
• 第一节 基于微卫星标记的长牡蛎三倍体鉴定56-64
• 0 引言56-57
• 1 材料与方法57-58
• 1.1 亲贝获取、受精、三倍体诱导及样品采集57
• 1.2 DNA提取、PCR扩增及基因型分析57
• 1.3 流式细胞仪倍性鉴定57-58
• 2 结果58-61
• 2.1 微卫星位点筛选及二倍体验证58-59
• 2.2 微卫星标记及流式细胞仪方法倍性检测结果分析59-60
• 2.3 倍性检测所需微卫星数目分析60-61
• 3 讨论61-64
• 3.1 长牡蛎倍性检测方法比较61-62
• 3.2 倍性检测所需微卫星位点数与微卫星-着丝粒重组率关系62
• 3.3 无效等位基因62-64
• 第二节 长牡蛎三倍体基因组DNA甲基化F-MSAP分析64-74
• 0 引言64
• 1 材料与方法64-66
• 1.1 实验材料64
• 1.2 实验方法64-65
• 1.3 数据分析65-66
• 2 结果66-72
• 2.1 长牡蛎二倍体与三倍体整体DNA甲基化水平比较66-67
• 2.2 长牡蛎二倍体与三倍体的表观遗传结构分析67-68
• 2.3 长牡蛎二倍体与三倍体亲子间基因分离比较68-71
• 2.4 长牡蛎雄性特有甲基化位点71-72
• 3 讨论72-74
• 3.1 长牡蛎多倍体化过程中的DNA甲基化变异72-73
• 3.2 长牡蛎性别决定与DNA甲基化73-74
• 第三节 长牡蛎三倍体生殖相关基因表达与甲基化水平分析74-89
• 0 引言74
• 1 材料与方法74-79
• 1.1 实验材料74-75
• 1.2 实验方法75-79
• 2 结果79-86
• 2.1 DNA和RNA的提取及质量检测79
• 2.2 目的基因与内参基因的扩增效率验证79
• 2.3 二倍体与三倍体与三倍体长牡蛎生殖相关基因mRNA表达差异79-81
• 2.4 putative Vg、caER基因CpG富集区的DNA甲基化模式81-86
• 3 讨论86-89
• 3.1 长牡蛎二倍体与三倍体差异表达基因分析86-88
• 3.2 DNA甲基化与基因表达分析88-89
• 第四章 长牡蛎人工选育群体DNA甲基化研究89-100
• 0 引言89
• 1 材料与方法89-92
• 1.1 实验材料89-90
• 1.2 实验方法90-91
• 1.3 数据分析91-92
• 2 结果92-98
• 2.1 AFLP分析92-93
• 2.2 MSAP分析93-96
• 2.3 表观遗传多样性与遗传多样性相关性分析96-98
• 3 讨论98-100
• 3.1 选育群体遗传多样性与变异98
• 3.2 人工选育过程中的DNA甲基化变异98-100
• 总结100-102
• 参考文献102-127
• 致谢127-128
• 个人简历128-129
• 学术成果129

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本文编号：395398